1、 ：液相色谱串联质谱法测定发酵肉制品中种生物胺的含量华永有，陈碧榕，周丽芳，林坚（福建省疾病预防控制中心福建省人兽共患病研究重点实验室，福州 ；漳浦县疾病预防控制中心，漳州 ；厦门大学 附属中山医院，厦门 ）摘要：提出了液相色谱串联质谱法测定发酵肉制品中组胺、酪胺、腐胺、尸胺和色胺等种生物胺含量的方法。样品经（体积分数）高氯酸溶液 提取次，合并上清液，用 氢氧化钠溶液调节上述上清液 至，用（体积分数，下同）高氯酸溶液定容至。取上述溶液，与 高氯酸溶液混匀，经正己烷净化次。取上述溶液，用乙腈定容至，过滤。以 色谱柱为固定相，以含 甲酸铵的（体积分数，下同）甲酸溶液含 甲酸铵、甲酸的乙腈溶液为流动
2、相进行梯度洗脱，采用液相色谱串联质谱法测定滤液中种生物胺的含量。结果表明：种生物胺的质量浓度在一定范围内与对应的峰面积呈线性关系，检出限（）为 。按标准加入法进行回收试验，回收率为 ，测定值的相对标准偏差（）为 。关键词：液相色谱串联质谱法；发酵肉制品；生物胺中图分类号：文献标志码：文章编号：（）生物胺是一组具有生物活性的低相对分子质量、热稳定且不挥发的碱性含氮化合物，广泛存在于鱼类及鱼制品、发酵食品中。它的产生与上述食品中因有害微生物活动而产生的氨基酸脱羧酶密切相关，可被用作评价食品质量保存的化学指标，食品中生物胺含量越高，其质量越差，腐败程度也越高。适量的生物胺有利于人体的健康，但是过量的
3、生物胺会引起头疼、血压变化、呼吸紊乱、心悸、呕吐等。但由于生物胺种类多，毒性差异大，且有的生物胺之间还可以相互转化，同时人体对生物胺的反应也存在差异，目前还没有统一的标准来衡量生物胺的毒性。目前一些国家尝试根据不同食品的特性给出了生物胺的限量标准，以保障食品安全。美国食品药品监督管理局合规政策指南中规定水产品中组收稿日期：基金项目：福建省卫生健康科技计划项目（）；福建省科技创新平台建设项目（）作者简介：华永有，副主任技师，硕士，研究方向为卫生检验，胺质量分数不得超过 ；欧盟规定食品中组胺质量分数不得超过 ，酪胺质量分数在 内；国 家 标 准 食品安全国家标准 鲜、冻动物性水产品 仅规定了高组胺
4、鱼类中组胺质量分数不得超过 ，其他海水鱼类中不超过 。目前国内外对食品中生物胺的研究主要集中在水产 品、酱 油及 发 酵 酒 类中，发 酵 肉 制品 中的生物胺报道较少。生物胺的测定方法主要有液相色谱法、液相色谱质谱法 等。在上述研究的基础上，本工作选取毒性较大的组胺和酪胺，以及对其毒性具有加成作用的腐胺、尸胺和色胺作为检测指标，采用液相色谱串联质谱法测定发酵肉制品中种生物胺的含量，该方法有效地克服了生物胺缺乏发色基团的问题，还省去了繁琐的衍生步骤，从而缩短了分析时间，且具有更好的重现性，并运用建立的方法对市售发酵肉制品进行检测，结果令人满意。华永有，等：液相色谱串联质谱法测定发酵肉制品中种生
5、物胺的含量试验部分仪器与试剂 型 液相 色 谱串 联 质 谱仪；型纯水一体化系统；型旋涡混合仪；型离心机；型 数 控 超 声 波 清 洗 器；型 电 子天平。单标准储备溶液：，分别称取适量的各生物胺标准品，用水溶解并定容至 棕色容量瓶中，于冰箱中冷藏保存。单标准溶液的配制以各生物胺单体计算，称取标准品时应对其中的盐酸盐进行折算。混合标准溶液系列：移取适量的 的单标准储备溶液，用含（体积分数，下同）高氯酸的乙腈溶液逐级稀释，配制成色胺、组胺、酪胺的质量浓度均为，腐胺和尸胺的质量浓度均为，的混合标准溶液系列。组胺盐酸盐、腐胺盐酸盐标准品的纯度大于；酪胺盐酸盐、尸胺、色胺标准品的纯度大于；高氯酸、氢
6、氧化钠、正己烷均为优级纯；乙腈、甲酸、甲酸铵均为色谱纯；试验用水为超纯水。仪器工作条件色谱条件 色 谱 柱（，）；柱 温 ；进 样 量；流 量 ；流 动 相 为 含 甲酸铵的（体积分数，下同）甲酸溶液；为含 甲酸铵、甲酸的乙腈溶液。梯 度 洗脱程序：时，为 ；时，由 降至；时，由 跳转至，保持 ；时，由升至 。质谱条件电喷雾离子（）源，正离子（）模式，离子源温度 ；脱溶剂气温度 ，脱溶剂气流量 ；碰 撞 气 为 氩 气；采 用 多 反 应 监 测（）模式，其他质谱参数见表，其中“”表示定量子离子。试验方法称取（精确至）样品，置于 离心表质谱参数 化合物质荷比（）母离子子离子碰撞能量 毛细管电压
7、 锥孔电压组胺 ，尸胺 ，腐胺 ，酪胺 ，色胺 ，管中，加入 （体积分数，下同）高氯酸溶液，涡旋 ，冰浴超声 ，以转速 离心 ；样品残渣再加入 高氯酸溶液重复提取一次，合并上清液。用 氢氧化钠溶液调节上述上清液 至，用高氯酸溶液定容至。取上述溶液置于离心管中，加入 高氯酸溶液，混匀，再加正己烷，涡旋 ，离心，弃去正己烷层；再加入 正己烷重复净化一次，弃去正己烷层。吸取 上述溶液，用乙腈定容至，混匀，过 的聚四氟乙烯亲水滤膜于进样瓶中，按照仪器工作条件测定。若样品脂肪含量高时，可在正己烷净化之前，将提取液放入冷冻柜中放置左右，以转速 离心 ，再用正己烷进行两次净化。结果与讨论前处理条件的优化发酵
8、肉制品的基质较为复杂，特别是脂类的含量较高，若净化不够完全，将会大大降低检测结果的准确度。除脂常用的有机溶剂有乙醚、石油醚、乙酸乙酯、正己烷等，试验对这几种有机溶剂进行考察，结果发现：石油醚处理时分层不够清晰；乙酸乙酯处理时会出现乳化现象；乙醚和正己烷效果均较为理想，但乙醚作为易制毒试剂，管理严格。因此，试验选择正己烷进行除脂处理。若样品脂肪含量高时，可在正己烷净化之前，将提取液放入冷冻柜中放置左右，出现明显的脂肪层凝结，将其置于离心机中以转速 离心 ，再用正己烷进行两次净化，能对基质中的脂类有更好的净化效果。质谱条件的优化优化质谱条件时，在 的流量下，将 的单标准溶液用蠕动泵注入到质谱华永有
9、，等：液相色谱串联质谱法测定发酵肉制品中种生物胺的含量仪中，在 模式下，选择合适的进行一级质谱扫描，确定母离子。接着，对母离子进行二级质谱扫描，确定每种物质的定性子离子和定量子离子，再优化碰撞能量等质谱参数使子离子的响应丰度达到最大，具体质谱参数见节。色谱条件的优化试验考察了（体积分数，下同）甲酸溶液乙 腈，甲 酸 铵 溶 液乙 腈，含 甲 酸 铵 的 甲 酸 溶 液含 甲酸铵、甲酸的乙腈溶液等流动相体系对目标物分离效果的影响。结果发现：以甲酸溶液乙腈、甲酸铵溶液乙腈为流动相体系时，尸胺出现两个峰，组胺和腐胺峰出现拖尾，分离效果不佳；以含 甲酸铵的 甲 酸 溶 液含 甲 酸 铵、甲酸的乙腈溶液
10、为流动相体系时，种生物胺的峰形尖锐、对称，分离效果好。试验进一步考察了 柱、柱和 柱对目标物分离效果的影响。结果显示：使用 柱分离时，组胺及腐胺的保留时间均小于 ，为保证分离效果，保留时间应延长；使用 柱分离时，组胺峰拖尾加重，腐胺峰则有明显毛刺；而使用 柱分离时，种生物胺的峰形、保留时间、响应强度均比较好。综合考虑，试验选择 柱分离，以含 甲酸铵的甲酸溶液含 甲酸铵、甲酸的乙腈溶液为流动相体系进行梯度洗脱，洗脱程序见节。在 优 化 的 仪器 工 作 条 件下，将 的混合 标 准 溶 液 进 样 分 析，色 谱 图 如 图所示。图色谱图 华永有，等：液相色谱串联质谱法测定发酵肉制品中种生物胺的
11、含量标准曲线、检出限和测定下限按照仪器工作条件测定混合标准溶液系列，以化合物的质量浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果表明，种生物胺的质量浓度在一定范围内与对应的峰面积呈线性关系，具体线性参数见表。按倍信噪比（）计算检出限（），按倍检出限计算测定下限，结果见表。表线性参数、检出限和测定下限 ，化合物线性范围（）线性回归方程相关系数检出限（）测定下限（）色胺 .酪胺 .组胺 .尸胺 .腐胺 .精密度和回收试验选取低浓度水平的发酵肉制品样品，分别进行个浓度水平的加标回收试验，每个浓度水平测定次，计算各化合物的回收率及测定值的相对标准偏差（），结果见表。表精密度和回收试验结果（）（）
12、化合物本底值（）加标量（）测定总量（）回收率 色胺 酪胺 组胺 尸胺 腐胺 由表可知，各化合物的回收率为 ，测定值的 为 ，均能满足方法学的要求。样品分析按照试验方法对市售 份发酵肉制品进行分析，结果表明：种生物胺均有不同程度检出；组胺和尸胺的检出率为 ，检出量依次为 ，；色胺、酪胺和腐胺的检出率分别为 ，检出量依次不超过，；种生物胺浓度水平从大到小依次为尸胺、腐胺、酪胺、组胺和色胺，其平均值依次为 ，。本工作通过优化质谱及色谱条件，提出了液相色谱串联质谱法测定发酵肉制品中种生物胺含量的方法。方法灵敏度高、精密度及准确度好，可用于发酵肉制品中种生物胺的同时测定。在实际发酵肉制品样品检测中发现，
13、生物胺均有不同程度检出，但目前我国还没有相关的限量标准。为保障人民健康，需要加强监测，尽快制订相关的标准。参考文献：王光强，俞剑燊，胡健，等食品中生物胺的研究进展食品科学，（）：，（）：，（）：吴曼铃，时瑞，胡锦鹏，等 咸鱼中生物胺的研究进展食品工业科技，（）：王静玉，曲映红，刘志东，等 不同贮藏条件下南美白对虾中生物胺的变化 食品与发酵工业，（）：李璇，刘琪，朱蔚姗，等 不同发酵豆制品中生物胺调查分析 食品安全质量检测学报，（）：华永有，等：液相色谱串联质谱法测定发酵肉制品中种生物胺的含量 张浩，王丽发酵酒中生物胺的研究进展食品安全导刊，（）：，：，（）：，（）：冉春霞，陈光静我国传统发酵肉制品中生物胺的研究进展 食品与发酵工业，（）：王春利，赵晓娟，王英姿白酒中种生物胺的高效液相色谱分析法 酿酒科技，（）：，：，：沙丽娜，吐尔洪买买提，阿孜古丽衣该木，等建立检测酱油中种生物胺的液相色谱串联质谱方法（）中国调味品，（）：陈召桂，郑国建，朱玲琳液相色谱串联质谱法测定腐乳中的生物胺 中国酿造，（）：魏泉增，汤雅，李伟民 液相色谱串联质谱测定食醋中生物胺含量中国酿造，（）：，（.，；.，；.，）：，（），（，），（，），（），（）：；