1、第 卷 第期 年月青 岛 科 技 大 学 学 报（自然科学版）（）文章编号：（）；：一种富含纳豆激酶蛋白饮品的工艺石晓丹，马骏，王家林（青岛科技大学 海洋科学与生物工程学院，山东 青岛 ）摘要：以豆浆和脱脂奶粉为底物进行发酵，制备出一种富含纳豆激酶的新型蛋白饮品，为改善其口味及提高纳豆激酶活性，分别研究了豆奶比、初始、接种量、发酵时间和发酵温度对蛋白饮品品质的影响。通过工艺优化得出在（豆浆）（牛奶）为、接种量为，下发酵 后制备得到的饮品呈乳白色，口感润滑带有豆奶香气，纳豆激酶活性高达 且微生物指标符合国家食品安全标准。关键词：纳豆激酶；液体发酵；复合饮料；响应面优化中图分类号：文献标志码：引用
2、格式：石晓丹，马骏，王家林一种富含纳豆激酶蛋白饮品的工艺探究青岛科技大学学报（自然科学版），（）：，（），（）：收稿日期：基金项目：国家绿肥产业技术体系项目（）作者简介：石晓丹（），女，硕士研究生 通信联系人 ，（，）：，：；随着人们生活水平不断提高，心脑血管疾病发病率持续增长，已成为超越恶性肿瘤的“头号健康杀手”。纳豆激酶作为一种微生物中的纤维蛋白溶解酶，能够有效防止血栓形成与动脉粥样硬化，还可以起到降低血压的效果，备受研究者关注。年一位日本学者首次从纳豆中发现纳豆激酶，随着产业发展，纳豆产品开始出现多样化，纳豆冻干粉、压 片糖 果、纳 豆激酶 胶囊等逐渐映入大众眼青 岛 科 技 大 学 学
3、 报（自然科学版）第 卷帘。近期，有研究者将纳豆芽孢杆菌接种于牛奶和豆奶中培养，以生产纳豆酸奶，相对于固体发酵工艺而言，液体发酵更有利于纳豆激酶的富集，且易实现规模化生产，液体发酵生产纳豆激酶已成为新趋势，但纳豆芽孢杆菌发酵产生的特殊氨味严重影响饮品口感。本研究以黄豆和奶粉为原料，通过混合底物的方式，接种纳豆菌发酵制成一种复合发酵饮品，并通过对其发酵工艺进行探索优化，以纳豆激酶活力和感官评分为标准，确保高酶活的同时有效改善传统纳豆类制品难闻的氨味。实验部分试剂与仪器黄豆、神农架大豆，山东济宁；脱脂奶粉，杜尔伯特伊利乳业有限责任公司；纳豆芽孢杆菌（，属枯草芽孢杆菌纳豆菌亚种，筛自市售滨梨纳豆）；
4、尿激酶、凝血酶以及纤维蛋白原均为分析纯，北京索莱宝有限公司；其他药品均为国产分析纯。恒温培养箱，型，上海一恒科技有限公司；压力蒸汽灭菌锅，型，浙江新丰医疗 器 械；精 密 恒 温 液 浴 槽，型，杭州雪中炭恒温技术有限公司；紫外可见分光光度计，型，北京普析通用仪器有限公司；高转速离心机，型，北京京立离心机有限公司。实验方法蛋白饮品制备工艺称取 大豆，清水洗净表面杂质，适量去离子水浸泡后将水沥净，取 去离子水进行磨浆，过孔径 筛过滤掉颗粒物质后蒸煮 。脱脂奶粉充分溶于 无菌水，二者按一定比例混合后接种纳豆芽孢杆菌，摇匀放入恒温培养箱发酵，将发酵好的成品放入冰箱 冷藏以上，即可得成熟的饮品。纳豆激
5、酶的提取及测定取发酵液于 离心 ，上清液即为粗酶液。本实验采用 酚法测定纳豆激酶的酶活，此方法相较于紫外分光光度法成本低，简单易行，但测得的酶活并不能完全等同于纤溶酶活力，所以建立了 酚法和紫外分光光度法这两种方法之间的相关性。紫外分光光度法）尿激酶酶活标准曲线的绘制。以不同活力单位的尿激酶溶液为标准，制作标准曲线，具体步骤如下：纤维蛋白原溶液在样品管和空白管分别加入 ，水浴 。凝血酶溶液在样品管和空白管分别加入 ，水浴 。尿激酶标准液在样品管加入 ，三氯乙酸在空白管加入 ，水浴反应。尿激酶标准液在空白管加入，三氯乙酸在样品管加入 ，水浴 ，离心取上清，下测吸光值。）紫外分光光度法测定纳豆激酶
6、活性。纳豆激酶纤溶活力的测定方法 同表（将尿激酶标准液替换成纳豆激酶样品）。酚法本工作采用朱宇刚的方法测定蛋白酶活力并加以改进。）酪氨酸标准曲线的绘制。操作步骤如表，以“”管调零分别测定 处各管的吸光度。以 为纵坐标，酪氨酸浓度为横坐标，绘制酪氨酸标准曲线。表酪氨酸标准曲线绘制的实验步骤 项目试剂 （酪氨酸）（）（酪氨酸标准液 （碳酸钠）（酚试剂）（去离子水）注：混匀、水浴 、测 值。）酚法纳豆激酶活性测定。每个试管中加 酪蛋白 水浴 ，实验组加 待测酶液，空白组先加 三氯乙酸后再加待测酶液，摇匀，水浴中保温 ，立即向实验组加入 三氯乙酸终止反应，离心后各取上清液，然后加入 碳酸钠溶液和 酚试
7、剂，于 水浴中显色 ，用分光光度计在 处测其吸光值。紫外分光光度法与 酚法相关性的建立取同一批次粗酶液进行梯度稀释，分别用 酚法和紫外分光光度法测不同浓度的酶活，建立这两种方法的相关性。第期石晓丹等：一种富含纳豆激酶蛋白饮品的工艺单因素实验本实验对传统的豆乳发酵进行了改良，选用混合底物从个因素入手，探索了其对蛋白饮品品质的影响，见表。表单因素实验方案 因素水平（豆浆）（牛奶）接种量 发酵温度 发酵时间 初始 注：加粗数值为默认水平，默认水平为原始水平（）。对于制得的蛋白饮品从纳豆激酶酶活力和感官两个方面进行评价，感官评价标准参考 中对发酵乳的感官要求，见表。单因素实验中，综合分数（纳豆激酶酶活
8、纳豆激酶酶活最高值）感官得分。表感官评价标准 分数性状及口感 乳白色、组织状态均匀、有香味、口感滑润 乳白色、组织状态较均匀、有淡淡香味、口感滑润 乳白色稍暗黄、组织状态较均匀、稍有氨味、口感稍涩 暗黄色、组织状态不均匀、氨味重、口感较涩 暗黄色、组织状态不均匀、有强烈的氨味、口感干涩响应面优化实验在单因素实验的基础上，为了探索多因素的交互作用对饮品发酵工艺的影响情况，本实验选用响应面法进行后续实验设计，根据前期单因素实验结果影响力大小，选择对其品质影响显著的因素作为自变量，其激酶活性和感官评价为响应值，响应面实验因素与水平见表。表 实验设计因素与水平 水平（豆浆）（牛奶）接种量发酵温度发酵时
9、间 微生物指标的测定参考 中发酵乳的食品安全标准，分别按照 大肠菌群平板计数法、金黄色葡萄球菌平板计数法、沙 门 氏 菌 检 验 以 及 霉菌和酵母菌检验对饮品进行了微生物指标的测定。结果与讨论纳豆激酶酶活的测定尿激酶标准曲线以尿激酶标准液浓度为横坐标，下的吸光值为纵坐标绘制标准曲线，见图。所得到尿激酶标准 曲 线 的 回 归 方 程 为 ，。图尿激酶标准曲线 酪氨酸标准曲线以酪氨酸浓度为横坐标，测得数据为纵坐标绘制酪氨酸标准曲线，见图。所得标准曲线的回归方程为 ，。图酪氨酸标准曲线 紫外分光光度法与 酚法相关性曲线以蛋白酶活力为横坐标，以纳豆激酶酶活为纵青 岛 科 技 大 学 学 报（自然科
10、学版）第 卷坐标建立这两种方法之间的相关性，绘制曲线见图。相关性方程为 ，相关性显著，所以可以用 酚法测定纳豆激酶的纤溶活性。图蛋白酶活力与纳豆激酶酶活相关性曲线 单因素实验结果豆奶体积比单因素实验不同（豆浆）（牛奶）条件下的纳豆激酶酶活和感官得分见图。图不同（豆浆）（牛奶）条件下的纳豆激酶酶活和感官得分 如图所示，混合底物发酵的纳豆激酶酶活和感官得分均高于单一底物发酵，在促进纳豆激酶合成方面，豆浆与牛奶有一定的交互作用，并且在豆奶体积比为时，蛋白饮品的纳豆激酶酶活最高，奶粉中含有丰富的蛋白质、矿物质和维生素等营养成分可能有利于纳豆激酶的合成，且组织状态均匀，有淡淡豆奶香味，口感滑润。各个水平
11、综合得分分别为：，。因此，在豆奶体积比单因素实验中选取豆奶体积为最佳水平。接种量单因素实验图为不同纳豆芽孢杆菌接种量条件下的纳豆激酶酶活和感官得分，其综合得分分别为：，。从图可以看出，复合乳的纳豆激酶酶活和感官得分均一开始随着接种量的增加而升高，但后续均有一定回落，因为接种的纳豆芽孢杆菌越多，其副产物增多，导致发酵后颜色暗黄、组织状态不均匀、氨味重，口感发涩，综合来看，接种量为时饮品品质最佳。图不同接种量条件下的纳豆激酶酶活和感官得分 发酵温度单因素实验不同发酵温度下的纳豆激酶酶活和感官得分见图。图不同发酵温度下的纳豆激酶酶活和感官得分 如图所示，当发酵温度从 到 时，纳豆激酶酶活较低，但从
12、到，酶活一直保持在较高水平，在 出现回落，可能是温度高，热量无法排散导致菌体生长缓慢。随着发酵温度进一步升高，发酵完成后出现凝固现象，颜色暗黄，氨味重，各水 平 下 蛋 白 饮 品 的 综 合 分 数 分 别 为：，。综合考量，为最佳发酵温度。发酵时间单因素实验不同发酵时间下的纳豆激酶酶活和感官得分见第期石晓丹等：一种富含纳豆激酶蛋白饮品的工艺图。不 同 发 酵 时 间 条 件 下 的 综 合 分 数 分 别 为 ，。随着发酵时间的增加，纳豆激酶酶活是一直升高的，但 以后，感官评分开始呈下降趋势，发酵时间太长，蛋白饮品氨味 变 重，形 态浑 浊暗黄 且口 感 变差，最 后选择 为最佳发酵时间。
13、图不同发酵时间下的纳豆激酶酶活和感官得分 单因素实验不同初始 下的纳豆激酶酶活和感官得分见图。图不同初始 下的纳豆激酶酶活和感官得分 从图中可以看出，初始 对纳豆激酶的表达量以及感官得分均有影响，不同初始 条件下其综 合 评 分 分 别 为 ，。但是没有进行 调节的底物初始 值为 ，发酵完成后综合分数为 ，与最高水平接近，从生产成本和工艺角度考虑，无需进行 调节。响应面优化实验结果响应面设计及方差分析利用 软件对实验数据进行分析，得到二次多项回归方程：纳豆 激 酶 酶 活（）。感官得 分（分）。实验设计及结果见表，方差分析结果见表和表。从表可以看出，工艺条件对纳豆激酶酶活影响大小顺序为：（豆浆
14、）（牛奶）发酵温度发酵时间接种量。据表可得，工艺条件对感官得分影响大小顺序为：接种量豆奶比发酵温度发酵时间。两个回归模型 极显著，同时失拟项 不显著，说明此实验模型与真实数据拟合程度良好，具有实践指导意义。各因素响应面交互作用分析利用 软件对影响纳豆激酶复合乳品质的个因素进行交互作用分析，结果见图和图。表响应面实验设计及结果 编号（豆浆）（牛奶）接种量发酵温度发酵时间纳豆激酶酶活（）感官得分 青 岛 科 技 大 学 学 报（自然科学版）第 卷续表编号（豆浆）（牛奶）接种量发酵温度发酵时间纳豆激酶酶活（）感官得分 表响应纳豆激酶酶活拟合回归方程的方差分析结果 方差来源平方和自由度方差值值显著性回
15、归模型 残差 失拟项 纯误差 合计 注：，。第期石晓丹等：一种富含纳豆激酶蛋白饮品的工艺表响应感官得分拟合回归方程的方差分析结果 方差来源平方和自由度方差值值显著性回归模型 残差 失拟项 纯误差 合计 注：，。由图可知，豆奶比接种量交互作用对纳豆激酶酶活的影响趋势呈一抛物曲面分布，曲面整体纵向跨度较大且等高线呈显著椭圆形，表明其影响显著；豆奶比和发酵温度交互作用呈一抛物曲面分布，且豆奶比对纳豆激酶酶活影响较大；豆奶比发酵时间二者交互作用对纳豆激酶酶活影响不显著；纳豆激酶酶活随豆奶比和发酵时间增加均呈现先增后减变化。当接种量小于时，从抛物曲面可以看出，纳豆激酶酶活随接种量增加有所提升，呈正相关，
16、而当接种量大于时，其相关关系发生转折；同理纳豆激酶酶活随发酵温度变化的临界最佳参数为 附近；接种量和发酵时间对纳豆激酶酶活的影响也呈先升后降变化趋势；发酵温度发酵时间交互作用中，发酵温度为纳豆激酶酶活的敏感影响因子。由图 可知，豆奶比接种量交互作用表现为感官得分随其增加均呈先增后减趋势，相较而言，接种量对感官得分的贡献率较豆奶比大；豆奶比和发酵温度在交互作用中对感官得分影响相当；豆奶比发酵时间二者交互作用呈抛物曲面分布，纵向跨度大，对感官得分影响显著。当接种量小于 时，感官得分与接种量呈正相关，接种量在 近取值时为感官得分的临界最佳工艺参数；同理发酵温度临界最佳参数为 左右；接种量和发酵时间对感官得分的影响均呈先升后降变化趋势；发酵温度发酵时间交互作用中，均引起曲面先增后减大幅度波动，对感官得分有显著影响。最优发酵条件的确定及验证根据软件预测结果，纳豆激酶酶活在豆奶比、接种量、发酵温度、发酵时间等因素交互作用下的最优发酵工艺：（豆浆）（牛奶）、接种量 、发酵温度 、发酵时间 ，在此条件下模型预测的纳豆激酶酶活为 、感官得分 分。结合实际工艺设置的可行性，取（豆浆）（牛奶）、接种量、发酵