1、第 卷 第 期 年 月北京生物医学工程 .基金项目：国家重点研发计划项目（）资助作者单位：中国医学科学院基础医学研究所，北京协和医学院基础学院（北京）通信作者：许 海 燕，：.；孟 洁，：.氧化铁纳米颗粒对静止状态白血病细胞的作用研究李宛清 张雪 温涛 刘健 孟洁 许海燕摘 要 目的 研究二巯基丁二酸修饰的四氧化三铁纳米颗粒（）对静止状态白血病细胞的作用及机制。方法 利用透射电镜观察纳米颗粒形貌；用低血清培养基诱导细胞进入静止状态，采用普鲁士蓝染色法与邻二氮菲铁定量法检测 进入 细胞的情况；通过乳酸脱氢酶法、细胞氧化应激荧光探针和凋亡检测试剂分析 对 细胞的作用。结果 可进入静止状态的 细胞，
2、细胞内铁含量与 浓度成正比；与此同时，细胞活性降低，细胞内活性氧（，）与脂质过氧化物水平升高，细胞发生凋亡。正常培养的 细胞活性和氧化应激水平不受 的影响。结论 可进入静止状态的白血病细胞并引起细胞凋亡。关键词 氧化铁纳米颗粒；白血病细胞；静止；氧化应激；凋亡：.中图分类号.文献标志码 文章编号（）本文著录格式 李宛清，张雪，温涛，等 氧化铁纳米颗粒对静止状态白血病细胞的作用研究北京生物医学工程，（）：，（）：，：（：.）；（：.）【】（）（），（），【】；引言氧化铁纳米颗粒的核心为四氧化三铁或三氧化二铁纳米晶，外层通常被有机分子修饰或被高分子包被，具有超顺磁响应性和良好的生物相容性，广泛用于
3、生物医学领域的研究，主要包括磁共振成像造影剂、药物递送系统、磁分离、医学检测、补铁药物以及肿瘤磁热治疗剂等。近年来有研究发现，氧化铁纳米颗粒本身在一定条件下也可引起包括脑肿瘤、乳腺癌、肝癌和结直肠癌等在内的多种肿瘤细胞的死亡，并在荷瘤动物体内抑制肿瘤细胞的生长与转移。一项研究表明，临床应用的静脉注射补铁剂 纳米颗粒（）能够增加膜铁转运蛋白（，）低表达的白血病细胞内的铁含量，由此引起细胞发生氧化应激而死亡，可显著延长白血病动物的生存期，提示其在白血病治疗中有应用潜力。但是，有很多类型的白血病细胞能正常表达甚至过表达，本文的目的是研究白血病细胞所处状态与其对氧化铁纳米颗粒敏感性的关系，探讨氧化铁纳
4、米颗粒是否能有效杀伤 正常表达的白血病细胞，以期为白血病临床治疗提供一种潜在的辅助性治疗药物。材料与方法.主要材料与试剂纳米颗粒（）水溶液购自南京东纳生物科技有限公司；人急性髓细胞性白血病细胞系 细胞为中国医学科学院血液学研究所王敏教授惠赠；胎牛血清（，）和青霉素 链霉素溶液购自 公司；盐酸羟胺、邻二氮菲、醋酸钠与，二 氯 二 氢 荧 光 素 二 乙 酸 酯（，）购自公 司；乳 酸 脱 氢 酶（，）试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒和细胞脂质过氧化物检测试剂盒购自同仁化学公司；抗 人 抗 体 购 自 公 司；抗 人 与 抗体购自 公司。.透射电镜将 水溶液滴加到铜网上，待彻底干燥后，使用透射电镜（）观
5、察。.细胞培养在 基础培养基中添加 、链霉素和 青霉素，配制成完全培养基（，）；添加.的 培 养 基 为 饥 饿 培 养 基（，）。细胞先培养于完全培养基中。进行实验前，收集细胞悬液，离心弃上清后，将细胞分别重悬于 和 中。.细胞活性检测将 细胞培养于 或 中，细胞密度为 。取 细胞悬液接种于圆底 孔板，将不同体积的 水溶液加入到孔中，终浓度为、和 。孵育 后离心，取上清液至酶标板中，用酶标仪测定 的吸光度；其中，以全细胞裂解作为阳性对照孔，同时设各组背景孔，每组至少设置三个重复样。按照 试剂盒说明书计算细胞活性率。.普鲁士蓝染色将 细胞培养于 或 中，加入，终浓度为 ，孵育，用 多聚甲醛溶液
6、室温固定 ，经 洗涤后，甩片至载玻片上晾干。加普鲁士蓝染液，后用蒸馏水冲洗、晾干；加入伊红染液复染 。用显微镜（，）观察细胞并采集图像。.细胞内铁定量（邻二氮菲法）将 细胞培养于 中，密度为 个，取.细胞悬液接种到 孔板中，加入，终浓度分别为、和 。孵育 后，加入 裂解液处理 ；加入 浓盐酸，室温反应 。取出 溶液，加入 （质量浓度）氢氧化钠溶液调节 至 后，依次加入 盐酸羟胺溶液、.邻二氮菲溶液、乙酸钠溶液，混匀静置，检测溶液在 处的吸光度。将 粉末溶解于纯水，配制浓度为、和 的标准溶液。根据铁标准溶液的浓度及其对应的吸光值绘制标准曲线，计算细胞中铁含量。.流式细胞术检测将 细胞培养于 或
7、中，密度为个，接种于 孔板，每孔.，加入第 期 李宛清，等：氧化铁纳米颗粒对静止状态白血病细胞的作用研究，终浓度为、和 。后收集细胞，分别加入荧光探针（）、（）或 和，避光孵育后 洗涤和重悬，用流式细胞仪（，）检测细胞荧光强度。.统计分析实验数据以平均值标准误（）表示。使用单因素方差分析（）进行统计学分析，.时具有显著性差异。结果.引起静止状态 细胞损伤 有研究表明，在血清饥饿培养条件下，白血病细胞会进入静止状态。因此，本文采用饥饿培养基和完全培养基培养 细胞，研究其在静止和正常生长状态下，对 的敏感性。水溶液可以稳定地分散在水和培养基中，其氧化铁核心呈球形，直径为 ，大多数颗粒为单分散（图）
8、。在完全培养基中加入 后，即使纳米颗粒的浓度升高到 ，细胞的活性与对照组相比也无明显变化图（）。但是，在血清饥饿条件下，经、和 处理后，细胞活性分别降低到、和图（），表明静止状态下 细胞对 较 为 敏 感，而 对正常生长状态的 细胞的活性没有显著影响。图 的透射电镜图 ，.图 对 细胞活性的影响 .可进入静止状态的细胞 进一步研究发现，细胞处于静止或正常生长状态时，对 的摄取显著不同图（）。在 中将 细胞与 共孵育 后用普鲁士蓝染色，可观察到细胞内有大量蓝染颗粒，而在 中，同样浓度的 则很少进入细胞。上述结果表明，能够进入静止状态的 细胞，使细胞内铁含量增加。利用邻二氮菲法对细胞中的总铁离子进
9、行定量，结果表明，细胞内总铁离子浓度随 浓度升高而增加图（），与普鲁士蓝染色结果相符。.引起 细胞氧化应激 氧化铁纳米颗粒可通过其过氧化物酶活性而引起细胞内氧化应激。此外，铁离子也能够与细胞内过氧化氢发生芬顿反应，引起活性氧的产生而导致细胞死亡。研究结果显示，在 中，未引起正常生长的 细胞的活性氧（，）和脂质过氧化物水平的改变图（）、（）；但是，会对静止状态的 细胞的 水平产生显著影响，随着 浓度升高，细胞内 的平均荧光强度（，）分别为对照组的.、.和.倍；的 分别为对照组的.、.、.倍图（）、北京生物医学工程 第 卷，图 细胞对 的摄取情况 ，图 对 细胞氧化应激的影响 第 期 李宛清，等：
10、氧化铁纳米颗粒对静止状态白血病细胞的作用研究，图 对 细胞凋亡的影响 （），表明 能够使静止状态的 细胞内活性氧水平升高，脂质过氧化物增加，有可能导致氧化应激损伤。.诱导 细胞凋亡当氧化应激达到一定水平后会导致白血病细胞凋亡。用 凋亡检测试剂盒检测的结果显示，在 中，细胞与、和 的 共培养后，平均凋亡率分别达到.、.和.（图），表明 能够诱导静止状态的 细胞发生浓度依赖性凋亡。讨论本文通过比较 和.血清培养条件下 对 细胞的杀伤作用，明确了静止状态下的 细胞对 更敏感，在与较低浓度 共孵育较短时间后，静止状态的 细胞会摄取大量纳米颗粒，出现明显的氧化应激损伤并发生凋亡，提示 对静止状态的白血病
11、细胞具有较强的毒性作用，但是对处于正常生长状态的白血病细胞影响不明显。是唯一已知的细胞铁离子外排蛋白，细胞的 表达为.，属于中等表达水平，具有一定的铁外排能力；与此同时，难以进入正常生长状态的 细胞；因此，对细胞活性没有影响。本文中所观察到的氧化铁纳米颗粒的细胞毒性可能来自两个途径，一是纳米颗粒进入到静止状态的白血病细胞内后，通过胞内的酶解产生铁离子，铁离子与过氧化氢发生芬顿反应，产生活性氧，由此导致细胞死亡；另一个是 在酸性条件下具有过氧化物酶活性，当被吞噬到溶酶体中后，可以催化过氧化氢产生羟自由基，直接氧化脂质物质，产生脂质氧化物，从而导致细胞死亡。结论本研究分析了在不同血清比例条件下，二
12、巯基丁二酸修饰的四氧化三铁纳米颗粒（）对白血病细胞 活性、氧化应激及凋亡的影响，表明 可进入静止状态的 细胞，使细胞内铁浓度升高，引起细胞内氧化应激损伤，诱导细胞凋亡；而对正常生长状态的 细胞的活性则不产生明显的影响。参考文献 ，（）：，：，（）：，（）：，：，（）：，（）：（下转第 页）北京生物医学工程 第 卷金骨植入物镍离子释放监测的问题，可为镍钛形状记忆合金骨植入物的风险评估提供依据，确保植入物在临床使用过程中镍离子的析出不会对人体造成伤害，保证其临床使用的安全性。参考文献 中国组织工程研究与临床康复杂志社学术部医用 形状记忆合金在中国临床医学领域的应用 中国组织工程研究与临床康复，（）
13、：王琛，夏露，陈亚明镍离子对小鼠成纤维细胞毒性的实验研究口腔医学，（）：，（）：李政宁，伍伟锋，刘唐威先天性心脏病封堵器镍对人体的影响国际心血管病杂志，（）：，（）：康立娟，孙凤春 镍与人体健康及毒理作用 世界元素医学，（）：，（）：曹宏梅，赖宏伟，董树国，等微量元素镍概论广东微量元素科学，（）：王海鹰，鲍善芬，赵霖，等镍钛形状记忆合金骨内植入生物安全度的深入研究军医进修学院学报，（）：，（）：汤京龙，马立翠，温莉茵，等我国医用镍钛形状记忆合金标准现状分析 中国药事，（）：，（）：李明生物样品中的镍含量 国外医学医学地理分册，（）：郭静，米丛波 种镍钛正畸弓丝镍离子析出的体外实验口腔医学研究，（）：，（）：（收稿，修回）（上接第 页），（）：，：，（）：，：，（）：，：，：，（）：，（），（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，：，：（收稿，修回）北京生物医学工程 第 卷