1、 第 31 卷第 1 期 2023 年 3 月 纤 维 素 科 学 与 技 术 Journal of Cellulose Science and Technology Vol.31 No.1 Mar.2023 文章编号：1004-8405(2023)01-0001-09 DOI:10.16561/ki.xws.2023.01.05 氧化细菌纤维素氧化细菌纤维素/Ca2+/单宁酸复合止血海绵的制备单宁酸复合止血海绵的制备 刘 涛1,2，陈 琳1，钟春燕3，洪 枫1,2,3*（1.东华大学 生物与医学工程学院，上海 201620；2.国家先进功能纤维创新中心，江苏 苏州 215200；3.海南光宇
2、生物科技有限公司，海南 海口 570100）摘 要：以氧化细菌纤维素（OBC）为基底材料，通过配位络合作用将单宁酸（TA）和钙离子引入其中，作为功能单元以制备出能有效抗菌、止血的复合海绵。利用 SEM 观察了材料的微观结构，并通过抗菌、血液相容性和细胞毒性测试，综合评价了复合海绵。结果表明：钙离子能使每 10 mg 材料含单宁0.1 mg；OBC/Ca2+/TA复合海绵的孔隙率为71.3%，吸水量为78.9 g/g，对大肠杆菌的抑菌率为42.7%，金黄色葡萄球菌抑菌率提升到 94.2%；OBC/Ca2+/TA 溶血率为 1.5%，具备良好的血液和细胞相容性。关键词：TEMPO 氧化；细菌纤维素
3、；多酚钙离子络合；止血海绵；抗菌；生物医用材料 中图分类号：R318.08 文献标识码：A 理想的体内止血材料应具备快速止血能力、良好的细胞相容性、抗菌和生物体内可降解性。目前有许多材料可用作为止血材料1，包括胶原2、壳聚糖3、藻酸盐4、明胶5以及各种凝血成分6等都已经被证实在促凝血方面具备很好的效果。但它们的使用仍存在不足，因为存在感染和较为严重的过敏反应7。细菌纤维素（bacterial cellulose,BC）海绵被认为具备良好的生物相容性8、渗透性和吸水能力9。另外，由于人体内并不存在纤维素酶，BC 海绵在体内难以降解，因此制备成体内可降解止血海绵需要对 BC加以改性，而适当的氧化改
4、性处理则可大幅度提高 BC 的降解性，使之满足体内降解的要求10。目前，常用 2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧化物自由基（TEMPO）对 BC 进行氧化改性3,11。氧化细菌纤维素（OBC）与氧化再生纤维素（ORC）具备同样的结构单元，同理 OBC 中的羧基基团将不可避免的造成创口周围的局部环境酸性化，这不利于创口愈合10。此外，OBC 的抗菌性能有限，无法预防耐酸性细菌或真菌的感染12并且 OBC 的体内降解性相对较差，同类的 ORC 完全吸收需要长达 8 周左右的时间13。为了更好的改善OBC 海绵的性能，需与其他能够抗菌以及抗炎性能的物质联用。单宁酸（tannic acid,TA）是一
5、种天然多酚类有机化合物，具备止血14、抗氧化和抗菌等多种功能15。造成炎症的原因包括氧化应激，TA 则被认为能够有效防止组织中的氧化应激反应，可以用于促进伤口愈合16-17。TA 能够通过多酚羟基结构和金属离子进行配位组装，形成金属有机分子纳米组装材料18。目前，很多研究集中在 TA 与金属离子的组装上，在生物医学领域有许多应用，包括抗菌涂层、活细胞保护、自愈和抗氧化涂层19。鉴于钙离子（Ca2+）作为参与凝血级联的人凝血因子，能够促进血小板活化和聚集20。本文通过 TA与钙离子配位组装，向 OBC 海绵中引入 TA 抗菌、抗氧化涂层，在不破坏 OBC 海绵整体结构和性能的基 收稿日期：202
6、3-02-10 基金项目：国家先进功能纤维创新中心重点项目（HX105210640）；海南省重点研发计划项目（ZDYF2021GXJS025）。作者简介：刘 涛（1999），男，江西南昌人，硕士；研究方向：止血抗菌医用材料的制备及表征。*通讯作者：洪 枫（1970），男，教授；研究方向：细菌纤维素的低成本制备及其高值应用。 2 纤 维 素 科 学 与 技 术 第31卷 础上延伸其适用范围。同时在此基础上调整制备工艺，研究了复合海绵的止血、抗菌、细胞毒性以获得符合预期目标的止血海绵。1 实验 1.1 试剂与材料 细菌纤维素由本实验室保藏木葡糖醋酸杆菌 Komagataeibacter xylin
7、us ATCC-1 发酵获得，2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧化物自由基（TEMPO）购自阿拉丁上海试剂有限公司。单宁酸购自上海易恩化学技术有限公司，高糖培养基、血清和双抗购自美国 Life Technologies 公司。兔全血购自南京森贝伽生物科技有限公司，CCK-8 和 BCA 试剂来自碧云天生物技术有限公司。大肠杆菌和金黄色葡萄球菌购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。1.2 OBC/Ca2+/TA 复合海绵的制备 首先精确称取 0.2 g 冻干后的 OBC 分散在 20 mL 的去离子水中制备成 OBC 悬液。随后在磁力搅拌状态下加入 20 mg TA 以及 10 mg 钙离子，持续
8、搅拌 30 min 后离心收取沉淀并用去离子水清洗三次。最后重悬沉淀至 20 mL，冷冻干燥获得复合海绵（OBC/Ca2+/TA）。同时制备了纯氧化纤维素海绵（OBC）以及不含金属离子的单宁酸复合海绵（OBC/TA）。1.3 复合海绵微观结构观察 OBC、OBC/TA、OBC/Ca2+/TA 三种海绵的微观形态用场发射扫描电镜（SEM）拍照获得，将冻干好的海绵固定在电镜台上，10 mA 喷金处理 60 s，重复三次最后拍照。1.4 复合海绵的密度、孔隙率、吸水量以及单宁酸含量的测定 止血海绵的孔隙率通过液体替代法来测定。首先确定冻干海绵样品的初始重量（W1）和体积（V）。材料密度计算公式如式（
9、1）所示。材料密度（1）W1/V （1）其次，将样品浸入无水乙醇溶液中直至重量在室温下恒定，取出海绵并测量湿重（W2）。孔隙率计算公式如式（2）所示。孔隙率（）/%（W2W1)/(2V)100 （2）使用去离子水测定海绵样品的水吸收能力。首先将预先称重的干燥样品（W1）浸入有足够去离子水的培养皿中，在浸泡不同的时间点 5 min 后，小心取出吸水的海绵样品并用滤纸除去样品上的多余液体，然后称重（W3）。使用以下公式计算出吸水量，每组样品五个平行：吸水量（g/g）（W3W1）/W1 （3）其中，W1为冷冻干燥后样品的干重，W2为浸泡酒精后的湿重，W3为浸泡去离子水后的湿重，1为冷冻干燥后海面的密
10、度，2为无水乙醇的密度，V 为冷冻干燥复合海绵的体积，为孔隙率。利用 BCA 试剂盒来测定海绵的单宁酸含量。按照试剂使用说明配置 BCA 工作液，将海绵重悬至终浓度为 1 mg/mL 的悬液，取 100 L 海绵悬液加入 BCA 工作液 500 L，37水浴反应 30 min。十倍稀释后取 200 L 加入 96 孔板测量其吸光度，对比标准曲线计算材料单宁酸含量。第 1 期 刘 涛等：氧化细菌纤维素/Ca2+/单宁酸复合止血海绵的制备 3 1.5 抗菌性能评估 海绵材料的抗菌性能通过使用大肠杆菌（E.coli）和金黄色葡萄球菌（S.aureus）两种菌株来进行评价。首先将已灭菌的材料平铺在孔板
11、底部，加入500 L PBS 浸润海绵。取100 L 菌液（105 cfu/mL）均匀地滴加在每个材料表面，然后在 25、120 r/min 孵育 24 h。孵育结束后，使用 PBS 将菌体数梯度稀释至 102 cfu/mL。取 100 L 稀释液涂布平板，平板倒置于 37恒温培养箱中培养 24 h 后用菌落计数仪计算菌落数目，每个样品设置四个平行。材料的抑菌率为：抑菌率（R）/%（N1N2）/N1100 （4）其中，N1为对照样平均菌落数目，N2为试验样品的平均菌落数目。1.6 血液相容性评估 通过血红细胞和血小板黏附测试来检测材料表面与血液的相互作用。取 10 mL 新鲜全血，100 g
12、离心10 min 分离血红细胞和富血小板血浆。将灭菌好的海绵平铺于孔板中，加入 2 mL 生理盐水，37孵育 30 min。吸干生理盐水后加入 500 L 红细胞悬液或富血小板血浆 37孵育 2 h，使其和材料充分接触。随后用超纯水清洗三次后加入 2 mL 4%的多聚甲醛固定红细胞和血小板，然后通过不同浓度乙醇（25%、50%、75%、95%和 100%）进行梯度脱水，每个梯度 15 min。然后用叔丁醇置换样品中的乙醇两次每次 15 min，冷冻干燥 48 h，并用 SEM 观察黏附效果。用兔全血来评估海绵材料的体外促凝血性能。首先往 5 mL 新鲜抗凝兔全血中加入 500 L 0.1 M
13、的氯化钙，轻轻混匀激活凝血过程。依次分别吸取 100 L 全血滴加到材料表面，37水浴 50 min 并分别在 0、10、20、30、40、50 min 时间点向材料所在孔板加入 2.5 mL 的去离子水涨破未形成血栓的红细胞，取 1 mL上清测定 540 nm 吸光度。各组海绵的血液安全性通过测定溶血率来判断。和先前实验一样孵育好材料，加入 100 L 红细胞悬液，37温育 1 h。取 1 mL 孵育液于离心管中，2 500 r 离心 5 min 去除未破损的红细胞，测定上清 545 nm 处吸光度。同时设置阳性对照（无菌水红细胞悬液）以及阴性对照（生理盐水红细胞悬液），溶血率计算公式如式（
14、5）所示。溶血率（X）/%（OD样品OD阴性）/（OD阳性OD阴性）100 （5）1.7 细胞相容性评估 通过浸提液对细胞相容性进行评估。首先在 96 孔板培养 L929 细胞待其平铺在孔板底部，弃去初始培养基并用 PBS 清洗三次。然后分别加入 100%和 50%浓度浸提液进行培养。培育 1、2、3 天后，加入 200 L CCK-8 反应液，37避光孵育 1 h 后移取 100 L 至另一 96 孔板中，测定450 nm处的吸光值并通过吸光值反映浸提液对细胞增殖的影响。最后弃去残余反应液并用PBS清洗，加 50 L 稀释 AM 染料。37避光孵育 30 min，拍摄荧光照片观察细胞数量以及
15、形态。2 结果与讨论 2.1 止血海绵材料的形貌和理化性能 图 1a 展现的是 OBC、OBC/TA 和 OBC/Ca2+/TA 微观形貌。从 SEM 图可以看出三种海绵表面具备多孔隙结构，层层的三维片状结构相互连接构成海绵整体。由于单宁酸和钙离子之间能够通过离子相互作用均匀的沉积材料表面21，海绵表面总体上相对均匀，没有出现单宁金属离子络合物堆积现象。4 纤 维 素 科 学 与 技 术 第31卷 钙离子的加入能提升TA 在海绵中的固定量，如图1b 所示，每10 mg OBC/TA 中单宁酸的含量为0.08 mg，而 OBC/Ca2+/TA 中单宁酸含量超过 0.1 mg。图 1c 显示 OB
16、C 和 OBC/TA 的密度为 5.7 和 5.8 mg/cm3，OBC/Ca2+/TA 的密度达到6.9 mg/cm3。以上结果均说明钙离子能有效和单宁络合，并将其固定于OBC 海绵中。如图 1d 所示，三组海绵的吸水量为 73.9 g/g、75.4 g/g 和 78.9 g/g，随 TA 浓度上升而上升。同时海绵材料的孔隙率分别为 71.9%、70.9%和 71.3%，如图 1e 所示，彼此之间不存在显著性差异。两组数据说明 TA能稍微提升 OBC 材料的吸水量，提升能力强弱与单位材料中所含的 TA 含量呈正相关。其次单宁酸-钙离子络合物的引入没有破坏 OBC 海绵的纳米结构，也不会改变其具备高孔隙率的优点，和其他 OBC 为基本材料的海绵一样拥有作为止血剂的潜力9-10。0.00.20.40.6单宁酸含量/(mg10 mg-1)OBCOBC/TAOBC/Ca2+/TA*b 02468OBC/Ca2+/TAOBC/TAOBCc密度/(mgcm-3)*020406080100OBC/Ca2+/TAOBC/TAOBC吸水量/(gg-1)d 020406080100OBC/Ca2+/TA