1、DOI:103969/j issn1672-7770 2023 02013论著一种小鼠背根神经节原代神经元细胞分离与培养的优化方法张皞晟，王培民【摘要】目的探索一种可以大量快速培养活力好且卫星胶质细胞污染少的原代神经元细胞的方法。方法混合酶溶液消化体式显微镜下提取的背根神经节(DRG)，随后接种于纤维连接蛋白提前包被的培养皿中，8 h 后更换含 5-氟尿嘧啶的维持培养基，抑制非神经元细胞增殖。结果分离培养的感觉神经元细胞在培养过程中可维持 15 d 左右，部分细胞可维持更长时间。原代细胞于第 3 天即可观察到交错的轴突网络，接种细胞密度大，卫星胶质细胞污染情况少，细胞在 7 d 之内可投入使用
2、，操作者经短时间训练后即可快速掌握方法。结论新方法在传统方法的基础上进行了改良，可获取较多数量细胞活性好、纯度高的原代神经元细胞，相较传统方法具有可操作性高，重复率高的优势。【关键词】背根神经节;神经元细胞;细胞培养;TRPA1【中图分类号】Q813 1+1;R651【文献标志码】A【文章编号】1672-7770(2023)02-0189-06An optimized method for isolation and culture of primary neurons from mouse dorsal rootganglion ZHANG Hao-sheng，WANG Pei-min In
3、stitute of Modern Biology，Nanjing University，Nanjing 210022，ChinaCorresponding author:WANG Pei-minAbstract:ObjectiveTo explore a method that can rapidly cultivate a large number of primaryneurons with good vitality and less pollution of satellite glial cells MethodsDorsal root ganglion(DRG)extracted
4、 under microscope was digested with mixed enzyme solution，and then inoculatedinto fibronectin coated culture dishAfter 8 hours，the maintenance medium containing 5-fluorouracil was changed to inhibit the proliferation of non-neuronal cells ResultsThe isolated andcultured sensory neuron cells could la
5、st for about 15 days，and some of them could last longer Onthe third day，the primary cells could observe the crisscross axon network The density of theinoculated cells was high，and the pollution of satellite glial cells was less The cells could be putinto use within 7 days The operator could quickly
6、master the method after a short period of trainingConclusionsThe new method is improved on the basis of the traditional method，which can obtaina large number of primary neurons with good cell activity and high purity Compared with thetraditional method，the new method has the advantages of high opera
7、bility and high repetition rateKey words:dorsal root ganglion;neuron cell;cell culture;TRPA1基金项目:国家自然科学基金资助项目(82074460);江苏省自然科学基金(BK20201501)作者单位:210022 南京，南京大学现代生物研究院(张皞晟);南京中医药大学附属医院骨伤科(王培民)通信作者:王培民原代背根神经节(dorsal root ganglion，DRG)感觉神经元被广泛运用于瘙痒1、疼痛2、神经损伤3、神经再生、细胞间相互作用4 以及轴突运输等方面的研究中。因此原代 DRG 感觉神经元
8、细胞的提取及培养，为识别新的药物分子靶标、基因功能、代谢差异等提供了材料5 6，然而如何有效且快速地提取培养原代 DRG 神经元细胞仍是难题。小鼠 DRG 原代培养方法多种多样，早期使用小鼠胚胎作为提取 DRG 感觉神经元的材料，操作难度大、耗时较长，长时间的手术操作增加了污染风险，体式显微镜下 DRG 提取难度极大，难以批量提取，所用试剂材料较多，耗费较大，耗时也较长7。近两年的研究中提出，使用马血清替代胎牛血清，从而抑制非神经元细胞增殖，但神经元的功能与神经元轴突分981临床神经外科杂志 2023 年第 20 卷第 2 期叉与再生长关联较小，无血清也可满足神经细胞再生需求8;但成纤维细胞与
9、卫星胶质细胞的存在对神经元生长影响较大。因此，在不影响神经元活性，尽可能减少卫星胶质细胞或成纤维细胞污染9 的前提下，快速、大量地提取原代 DRG 感觉神经元细胞，减少实验所需的花销，保证足够密度和数量的神经元细胞，是后续实验成功的前提。在过去的基础上，本研究比较并改良了原代 DRG 神经元的提取方法，依据此方法，在多脊柱水平培养了 DRG 内的感觉神经元细胞，并降低了实验的操作难度及时间。培养的原代神经元细胞，可以作为功能和遗传学研究的工具来验证在动物模型中的分子靶点。通过膜片钳记录、钙离子成像、免疫组化、基因敲除和病毒基因转染等实验方法，可以更准确地描述感觉神经元的基本生理特性10。这些方
10、法可以帮助研究新的靶受体或通道、细胞内信号转导、细胞间信号传递等11。通过微阵列测序、RNA 和全基因组测序等先进方法，利用全神经节或原代神经元帮助识别小鼠慢性疼痛和瘙痒的生物标志物已获得一定的成效12。此外，原代培养的 DRG 神经元细胞具有新的治疗干预包括基因治疗和细胞活动的光遗传学和化学遗传学操作的潜力，可应用于疼痛性疾病13、神经退行性疾病14 的病理生理及治疗研究，为特异性药物的研究及运用提供研究目标。1资料与方法1 1材料12 只 C57BL/6 小鼠，雌雄不限，8 周左右，体质量约 20 30 g，由南京中医药大学实验动物中心提供。使用随机数字表法进行动物分组，分为旧方法组与新方
11、法组。1 2试剂与仪器1 2 1试剂药品MEM-ALPHA 培养基(BI，01-042-1ACS);青 霉 素-链 霉 素 溶 液(HyCLone，SV30031);35 mm 细 胞 培 养 皿(Nest，706001);Collagenase Type I powder(Thermo，17100-017);人血浆纤维连蛋白(fibronectin human plasma，Sigma，F0895-1MG);脱 氧 尿 嘧 啶 核 苷(5-Fluoro-2-deoxyuridine，Sigma，F0503-100MG);分散酶(源叶生物，S25046-1g);胎牛血清(FBS)(Gibco)
12、;-tubulin 抗体(Sigma);GFAP 抗体(Sigma);荧光二抗(anti-rabbit);荧光二抗(anti-mouse);曲拉通 X-100(Triton X-100);DAPI;多 聚 甲 醛;PBS;ddH2O;QuickBlock 免疫染色一抗稀释液;QuickBlock 免疫染色封闭液;免疫荧光染色二抗稀释液;抗荧光淬灭封片液;TRPA1 抗体(Affinity Biosciences);TRPV4抗体(Affinity Biosciences);TRPM8 抗体(AffinityBiosciences);tau 抗体(Affinity Biosciences)，sy
13、napsin抗体(Affinity Biosciences)。12 2实验所用主要仪器CO2恒温细胞培养箱;体视显微镜;200 目细胞筛;倒置式显微镜;荧光显微镜;眼科显微镊子(尖端有齿);普通不锈钢剪刀;显微角膜剪直剪或弯剪(11 5 cm);普通剪刀;镊子;培 养 皿;流 式 细 胞 仪;HCA(Operetta，Perkinelmer，PE)。1 2 3用于提取与培养的试剂配置(1)提取培养基:MEM-ALPHA 培养基+2%血清，分装为 1 mL溶液并储存在 2 mL 离心管中，全程置于冰上;(2)混合消化酶:I 型胶原酶+分散酶(消化酶与分散酶各取 100 mg 溶于1 mL PBS
14、 或培养基内制成母液，母液浓度为 100 mg/mL，使用时稀释成工作液，浓度为 5 mg/mL)，1 mL 工作液装在 2 mL 离心管置于冰上，分装工作液在 20 保存时间不多于 3 个月;(3)完全培养基:MEM-ALPHA 培养基+10%FBS+1%双 抗;(4)Fibronectin:母 液 浓 度 为1 mg/mL，工作液:取 20 uL 溶于1 mL ddH2O;(5)5-Fluoro 1 5 mg/mL，取 1 mL 溶于 100 mL ddH2O;(6)换液培养基:MEM-ALPHA 培养基+5%FBS+1%双抗+1%5-Fluoro。1 3方法小鼠 DRG 原代神经元的提取
15、与培养，拟使用两种方法提取原代 DRG 神经元细胞。方法一参考任旺等的研究7，改良方法如下。1 3 1实验前准备在培养皿中滴加 1 mLFibronectin 溶液提前包被培养皿，于 37 恒温培养箱中浸泡 1 h，浸泡开始 20 min 后可以进行 DRG 原代提取实验。浸泡开始后即刻准备 75%乙醇溶液用于小鼠消毒，提取培养基以临时储存 DRG，混合消化酶溶液用于后续操作，准备妥当后可进行下一步实验。1 3 2小鼠 DRG 的分离小鼠备皮，脱颈处死，待完全死亡后置入提前预冷的 75%乙醇溶液浸泡消毒3 5 min，待消毒完毕，沿背部正中线剪开小鼠皮肤，向两侧钝性分离小鼠背部筋膜，此时可见小
16、鼠背部白色韧带组织，手术刀片沿韧带棘突交界处迅速离断韧带，随后使用刀柄向两侧钝性分离小鼠背部肌肉群，露出肌肉下附着于横突的韧带，刀片分离后，迅速清理周围肌肉组织，刀片离断脊柱，取出脊柱后，含双抗 PBS 冲洗，清除多余血液及影响视野的肌肉。以下操作均在体视显微镜下操作，清洗脊柱后沿正中线自椎间孔处剪开锥体，分为左右两半;091J Clin Neurosurg，April 2023，Vol 20，No 2必要时剪去棘突以方便分离锥体，清理椎间孔内的脊髓组织与神经纤维，注意动作轻柔缓慢，以防误将 DRG 连同脊髓组织与神经纤维一同清理;使用吸入 PBS 注射器冲洗椎间孔，清理多余血液，即可见侧隐窝;DRG 处于侧隐窝内，为淡黄色结节状组织，两端均有神经纤维组织，使用带齿眼科显微镊摄取 DRG 组织，轻轻提起后使用显微角膜剪(直剪或弯剪)剪断两端神经纤维;修理多余神经纤维后，将 DRG 置于提取培养基内;以相同方法摄取剩余 DRG 组织，提取过程中提取培养基全程置于 冰 上。见 图 1。每 只 小 鼠 至 少 提 取 20 个的 DRG。A:沿背部正中线剪开，暴露小鼠脊柱及周围肌肉;B:离断