1、2023年2月第29卷第2期February.2023 Vol.29 No.2实验淫羊藿通过ICA-miR-335-5p轴缓解骨质疏松症的生物信息学分析及实验研究*金垚1，徐鹏辉1，卞泗善2，滕加文2（1.山东中医药大学第一临床医学院，山东 济南250014；2.山东中医药大学附属医院，山东 济南250014）摘要目的：通过生物信息学结合动物实验探讨淫羊藿苷（ICA）上调miR-335-5p促进大鼠成骨分化缓解OP的分子机制。方法：利用TCMSP数据库筛选淫羊藿的主要活性成分及靶点，通过GEO数据库进行miR-335-5p的差异性分析，采用相应数据库预测miR-335-5p和OP的基因靶点，对
2、淫羊藿、miR-335-5p和OP靶点求交集，筛选出淫羊藿干预miR-335-5p治疗OP的基因；利用Metascape数据库进行富集分析，并用String数据库构建PPI网络筛选出Hub基因后，在AutoDock Tools 1.5.6软件中进行分子对接，模拟药效结合过程；采用RT-qPCR测定miR-335-5p在OP患者骨组织、骨质疏松症大鼠骨组织的表达，并测定成骨诱导OP患者BMSCs分化14 d后的miR-335-5p表达，口服ICA和/或过表达miR-335-5p治疗骨质疏松症大鼠10周后，检测成骨基因的表达，HE染色观察大鼠股骨干骺端骨组织微观结构。结果：淫羊藿主要活性成分有23
3、个、作用靶点有221个，淫羊藿调控miR-335-5p治疗OP的作用靶点有40个，富集分析涉及多条通路，分子对接结果显示淫羊藿苷与Hub蛋白均可形成稳定化合物发挥作用。实验研究发现，miR-335-5p在OP患者和OP大鼠的骨组织中低表达，ICA处理和/或过表达miR-335-5p可促进大鼠BMSCs成骨分化；HE染色显示造模大鼠经ICA处理和/或过表达miR-335-5p后骨小梁增多、排列紧密，部分新生骨组织形成，有效缓解了大鼠骨质疏松症。结论：淫羊藿苷可通过ICA-miR-335-5p轴促进大鼠成骨分化来缓解OP，为中药单体治疗OP提供了新的研究思路。关键词骨质疏松症；淫羊藿；淫羊藿苷；生
4、物信息学；BMSCs；成骨分化；大鼠中图分类号R285.5文献标识码A文章编号1672-951X（2023）02-0001-07DOI：10.13862/43-1446/r.2023.02.001Bioinformatics Analysis and Experimental Study of Yinyanghuo(Epimedium)inAlleviating Osteoporosis Through ICA-miR-335-5p AxisJINYao1,XU Penghui1,BIAN Sishan2,TENG Jiawen2(1.The First Clinical Medical Co
5、llege of Shandong University of Chinese Medicine,Jinan Shandong 250014,China;2.Affiliated Hospital of Shandong University of Chinese Medicine,Jinan Shandong 250014,China)AbstractObjective:To explore the molecular mechanism of icariin(ICA)up-regulating miR-335-5p topromote osteogenic differentiation
6、in rats and alleviate OP by bioinformatics combined with animal experiments.Methods:The TCMSP database was used to screen the main active components and targets of Yinyanghuo(Epimedium),the GEO database was used to analyze the differences of miR-335-5p,and the correspondingdatabase was used to predi
7、ct the gene targets of miR-335-5p and OP,and the intersection of Yinyanghuo(Epimedium),miR-335-5p and OP targets was used to screen the genes of Yinyanghuo(Epimedium)interferingwith miR-335-5p to treat OP.The Metascape database was used for enrichment analysis and the Stringdatabase was used to cons
8、truct a PPI network to screen out the Hub genes,then carry out molecular docking inAutoDock Tools 1.5.6 software to simulate the process of drug combination.RT-qPCR was used to determinethe expression of miR-335-5p in the bone tissue of OP patients and osteoporotic rats bone tissue,and theexpression
9、 of miR-335-5p after 14 days of differentiation of BMSCs induced by osteogenesis in OP patients.After 10 weeks of treatment with oral ICA and/or overexpression of miR-335-5p in osteoporotic rats,the引用：金垚，徐鹏辉，卞泗善，滕加文.淫羊藿通过ICA-miR-335-5p轴缓解骨质疏松症的生物信息学分析及实验研究J.中医药导报,2023,29(2):1-7,13.*基金项目：山东省自然科学基金面上项
10、目（ZR2020MH359）通信作者：滕加文，E-mail：12023年2月第29卷第2期February.2023 Vol.29 No.2骨质疏松症（osteoporosis，OP）是以骨密度降低、微观结构退化导致骨脆性增加的一种全身性骨代谢疾病1。人体骨骼发育成熟后，仍会不断进行骨骼重塑，即成骨与破骨活动形成动态平衡，完成骨骼的吸收与重建。正常生理情况下，骨吸收与骨形成是耦联的、平衡的，以保持正常的骨量。当骨吸收强于骨重建，造成骨丢失，则会发生骨质疏松症。由于骨质疏松症发病过程缓慢，无特殊临床表现，故骨折是该病的主要发现途径2。OP的治疗方法很多，主要包括生活方式调整、药物干预和康复治疗3
11、，而药物干预仍是主要的治疗方法。但由于OP发病机制复杂，目前OP的诊治状况并不理想4。骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）是骨髓腔内的一种纤维细胞干细胞，具有良好的自我复制能力及多分化潜能。研究5表明骨髓间充质干细胞的成骨分化受损是OP发生、发展的重要原因，在骨质疏松症的发生发展中起到重要作用。近年来，中医药在治疗OP方面疗效确切且副作用小，越来越受到人们的关注6。淫羊藿为临床治疗OP常用中药。其主要活性成分淫羊藿苷（icariin，ICA）是一种黄酮苷类物质7，具有免疫调节、抗炎、抗衰老、抗肿瘤等活性8。研究9表明，淫羊藿苷联合干细胞可增加绝
12、经后骨质疏松症大鼠骨量并改善其骨组织的微观结构。研究10显示，淫羊藿苷具有促进骨代谢和改善血液循环的功效，可调控Wnt、PI3K/AKT、mTOR及雌激素受体等相关信号通路，干预激素性股骨头缺血性坏死。多项研究均表明，ICA可以有效增强BMSCs的增殖和成骨分化，然而ICA影响BMSCs成骨分化和调节OP的具体机制仍不清楚。MicroRNA（miRNA）是一类存在于生物体内长度为2024个核苷酸的小RNA11。其在细胞内具有多向调节作用，包括细胞增殖、成骨分化和细胞凋亡等12。近年来，大量研究发现miRNA参与了OP的调控，有研究表明miR-335-5p可促进小鼠骨形成和再生。ICA可上调mi
13、R-335-5p的表达，保护大鼠骨微血管内皮细胞功能，从而减轻股骨头坏死13，但ICA能否在OP中调控miR-335-5p的表达还不清楚。生物信息学是结合系统生物学与多向药理学为研究基础，利用生物分子网络分析方法，选取特定节点进行新药设计和靶点分析的药理学分支14。其“多基因、多靶点”的研究特点与复杂疾病的治疗理念相吻合。阐述药物-靶点-基因-疾病之间的复杂网络关系，有利于进行新药研发和药物作用机制的研究15。本研究利用生物信息学分析淫羊藿、ICA、miR-335-5p与OP的作用关系，再结合实验研究探讨ICA调节miR-335-5p促进成骨分化缓解OP的分子机制。1材料与方法1.1分子网络学
14、分析1.1.1数据来源及差异性分析在GEO数据库（https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）16中检索数据集GSE93883进行规范化处理，运用GEO2R工具分析miR-335-5p表达的差异性，以P2为筛选标准。1.1.2miR-335-5p与OP的靶基因预测通过TargetScan（http:/www.Targetscan.org）、MiRTarBase（https:/ GeneCards（https:/www.genecards.org/）数据库进行检索，选取可信度1的数据作为疾病OP的靶基因。1.1.3淫羊藿活性成分与作用靶点筛选以淫羊藿作为中药名称在TCMSP
15、数据库（http:/ Tools 1.5.6软件对其进行删除水分子、添加氢原子、计算Gasteiger电荷等操作，输出保存为pdbqt格式。从Pubchem数据库（https:/pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）下载活性成分的3D结构文件并转换为pdb格式。采用Python软件包的PyMOL对蛋白质进行去除水分子及磷酸根等expression of osteogenic genes was detected,and HE staining was used to observe the microstructure of bonetissue in the epiphysis
16、of rat femoral shaft.Results:Yinyanghuo(Epimedium)had 23 main active componentsand 221 targets.Yinyanghuo(Epimedium)regulated 40 targets of miR-335-5p in the treatment of OP.Theenrichment analysis involved multiple pathways.The molecular docking results showed that icariin and Hubprotein can form stable compounds to play a role.The experimental study found that miR-335-5p was lowexpressed in the bone tissue of OP patients and OP rats,and ICA treatment and/or overexpression of miR-335-5p could pr