1、老年医学与保健 年第 卷第 期 ，醒神解郁汤对卒中后抑郁模型大鼠 平衡及海马神经损伤的影响祁丽丽，侯臻臻，童碧薇，陈祥，刘德志，张佳，周一心，韩振翔 上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院急诊科，上海；山东济宁职业技术学院生物与化学工程系，山东济宁；上海中医药大学附属第七人民医院，上海；上海顾村镇社区卫生服务中心，上海；上海中医药大学，上海；上海中医药大学附属曙光医院神经内科，上海；上海市浦东新区疾病预防控制中心，上海 基金项目：上海市浦东新区民生科研专项（）；上海市科委医学创新研究专项（）；上海市科委自然科学基金（）；上海市浦东新区卫生健康委国家中医药发展综合改革试验区建设项目（）；上海市浦东
2、新区名中医培养计划（）；上海市浦东新区领先人才培养计划（）；上海市浦东新区卫生系统优秀青年医学人才（）；国家中医药管理局中医药创新骨干人才培训项目（）通信作者：韩振翔，电子信箱：摘要 目的 研究醒神解郁汤在卒中后抑郁（）大鼠模型中，对脑组织中 平衡以及血清中 表达的影响，探究其影响神经损伤可能的作用机制。方法 只 大鼠随机分为假手术组、卒中后抑郁组、醒神解郁汤低 高剂量组以及舍曲林组。假手术组在大脑中动脉缺血再灌注（）术中只分离动脉不做阻断。卒中后抑郁组在 术后施加慢性温和性不可预见性应激压力（）以建立 模型；建模成功后，分别以醒神解郁汤低剂量（）、高剂量（）及舍曲林（）灌胃，连续 。记录大鼠
3、强迫游泳静止不动时间，利用透射电镜观察大鼠海马组织结构，分别采用 、检测大鼠脑组织 水平及血清 水平。结果 醒神解郁汤可明显改善卒中后抑郁模型大鼠海马组织神经损伤。与假手术组相比，卒中后抑郁组强迫游泳静止不动时间、水平、比值均显著增加，差异有统计学意义（.）。醒神解郁汤低、高剂量组与卒中后抑郁组相比，强迫游泳静止不动时间、水平、比值均明显下降，差异有统计学意义（）。结论 醒神解郁汤可通过调控大鼠 比值及血清 表达，改善卒中后抑郁大鼠的神经损伤。关键词 卒中后抑郁；醒神解郁汤；白介素；，；，；，；，；，；，；，：，：（），：，（）老年医学与保健 年第 卷第 期 ，（），（）（），（），（）；中风
4、是世界第 致死和致残原因的疾病。在中国，成年人致残致死的首位原因是脑卒中，且随着人口社会老龄化，心血管危险因素的暴露，我国老年脑卒中发病率整体呈上升趋势，目前，岁居民首次脑卒中标化发病率每年平均增长，我国 岁及以上人群脑卒中目前患病人数高达 万，中风后 年内超过 的患者合并有抑郁，而中国卒中后抑郁（，）的发生率和预后前瞻性队列研究（研究）发现，与不伴随有抑郁的卒中后患者相比，卒中后抑郁患者 年脑卒中复发风险增加，对防治老年卒中后抑郁有重要价值。目前已有研究证实，卒中后抑郁的发生发展与脑源性神经营养因子（，）密切相关。是一种重要的神经生长因子，可调节突触功能和神经元可塑性。水平与卒中后抑郁发病密
5、切相关，且其水平变化在一定程度上预示着卒中后抑郁的病情走向。本课题组前期临床研究发现，醒神解郁汤可明显改善卒中后抑郁患者汉密尔顿评分及认知功能，促进中风康复，改善生活质量。同时本课题组实验研究发现，醒神解郁汤可下调患者外周炎症因子、水平，上调抗炎因子、水平，改善促炎因子与抗炎因子平衡，并上调 水平。本研究为进一步探讨醒神解郁汤干预卒中后抑郁免疫炎症因子与神经营养因子机制，选取与卒中后抑郁发生发展密切相关的炎症因子白细胞介素（），探讨醒神解郁汤调控卒中后抑郁、水平，改善海马神经损伤，进而改善卒中后抑郁作用机制，旨在为防治预卒中后抑郁提供研究基础和依据。材料与方法 实验动物成年健康雄性 周龄 大鼠
6、 级，体质量 。由上海中医药大学实验动物中心提供。本研究中所进行的所有动物实验，依据国家相关法律规定及动物伦理学要求，经上海中医药大学动物中心动物伦理委员会批准后进行，伦理编号为。实验药品盐酸舍曲林片（辉瑞制药有限公司，国药准字）。醒神解郁汤，中药组成为石菖蒲（）、远志（）、党参（）、茯苓（）、生蒲黄（）、生黄芪（）、制半夏（）、僵蚕（）、秫 米（）、桂枝（），由上海市第七人民医院中药房提供。上述中药加蒸馏水浸泡 后分别加 和 蒸馏水煮沸 次，每次 ，合并 次水煎液，将水煎液浓度浓缩为，即醒神解郁汤低浓度，同法制备醒神解郁汤高浓度水煎液，浓度为 。主要试剂 酶联免疫法试剂盒：（武汉博士德生物公
7、司，批号）；抗体（公司，批号）。实验方法 卒中后抑郁动物模型的制备在前期研究基础上，参照 法建立大鼠右侧大脑中动脉缺血再灌注（，）模型。老年医学与保健 年第 卷第 期 ，手术过程中维持环境温度在 ，肛温维持在（），直至动物苏醒。苏醒后采用 法测定其神经功能缺损评分。分：无法自发行走；分：自由运动状态下向病变对侧旋转或偏移；分：抓住鼠尾，大鼠向病变对侧旋转或偏移；分：对于施加向病变对侧的侧压力抵抗能力下降；分：无法伸直病变对侧前肢，或者躯干向对侧屈曲；分：无神经功能显著缺损。根据评分标准将评分 分的模型大鼠纳入研究。在 模型基础上均给予 的慢性不可预见温和刺激（，）以建立 模型，具体压力措施为包
8、括禁食 、禁水 、行为限制 、潮湿垫料 、夜间照明 、倾笼 、强迫游泳，空瓶暴露，暴露异物 共 种刺激方法，每天随机 种。动物分组及给药用 中随机数字发生器将所有大鼠随机分为以下 组：假手术组、卒中后抑郁组、醒神解郁汤低、高剂量组、舍曲林组，每组 只。假手术组在 术中只分离动脉不做阻断，不给与慢性温和不可预见性应激压力（），以常规方式喂养；其余 组均先建立 模型，造模成功后均给予为期 的慢性温和不可预见性应激压力以建立卒中后抑郁模型。卒中后抑郁组（）在第 以糖水偏好测试确定抑郁表型出现后，不再给与外界刺激，以常规方式喂养；醒神解郁汤低剂量组（）、醒神解郁汤高剂量组（）在 模型的基础上分别给与醒
9、神解郁汤低剂量（）、高剂量（）灌胃，连续 ，每天 次；舍曲林组（）在 模型的基础上给与舍曲林（.）灌胃，连续 ，每天 次。本实验最终共入组 只大鼠，其中造模过程中大鼠死亡 只（假手术组死亡 只，卒中后抑郁组死亡 只，醒神解郁汤低剂量组死亡 只，醒神解郁汤高剂量组死亡 只，舍曲林组死亡 只）。指标检测 透射电镜步骤取材固定：取大鼠海马体组织，尽量减小牵拉、挤压组织与挫伤等机械损伤，组织体积控制在 以内，并迅速于电镜固定液 固定 。磷酸缓冲液（）漂洗 次，每次。后固定：的锇酸 磷酸缓冲液（）在室温下（）固定 。用 磷酸缓冲液（）漂洗 次，每次 。脱水：组织按顺序入、酒精、丙酮、丙酮上行脱水，每次
10、。渗透丙酮包埋剂 行 ，丙酮 包埋剂 于渗透过夜，纯 包埋剂包埋，将纯 包埋剂倒入包埋板，将样品插入包埋板后，并于 烤箱过夜。包埋：放置于 烤箱聚合 。切片：用超薄切片机行 超薄切片。染色：铀铅双染色如下，醋酸铀饱和酒精溶液，枸橼酸铅，分别染色，切片室温干燥过夜。透射电子显微镜下进行图像采集并分析。强迫游泳不动时间将实验大鼠单独放入 个盛水圆柱状容器内持续，确保大鼠的双脚不能触碰到容器底。记录大鼠在水中漂浮不动时间。水中漂浮不动定义为老鼠的头部保持在水面以外，停止挣扎，处于漂浮状态，或者为保证头部浮于水面之上，仅有细小的肢体运动。在造模开始第、周记录各组大鼠强迫游泳不动时间。实验指标检测（）血
11、清炎症因子 检测治疗结束后，戊巴比妥钠腹腔注射，麻醉后腹主动脉采血，离心 ；取上清液，采取酶联免疫吸附法，使用 试剂盒，并按照说明书的流程测定血清 水平。（）大鼠海马体组织 蛋白检测将海马体组织切成小块，每 组织添加 裂解物，用匀浆机研磨均匀，直至裂解液中的组织块消失，完全裂解后，然后取上清液；使用 法进行 蛋白检测：组织和细胞样品在含 光蛋白酶和磷酸酶抑制剂的 裂解缓冲液中裂解。蛋白质在 的 凝胶中电泳分离，然后转移到 膜或 膜上。用牛血清白蛋白在含 吐温的 盐缓冲液（）中封闭。膜与目的蛋白一抗在室温下孵育。膜在 中洗涤 次，用适当的二抗室温孵育。在 中洗涤 次后，在 曝光仪中使用 发光液检
12、测抗体的化学发光信号。统计学分析 所有数据采用 软件进行处理。计量资料以均数 标准差（）表示，方差齐性采用 检验，方差不齐性采用秩和检验；计量资料组间比较采用独立样本 检验，组内比较采用配对 检验，多组均数比较采用重复测量方差分析。表示差异有统计学意义。老年医学与保健 年第 卷第 期 ，结果 醒神解郁汤对卒中后抑郁（）大鼠海马体组织结构的影响 电镜下可见，卒中后抑郁组（）大鼠海马神经元超微结构发生改变，神经元细胞中重度水肿，细胞核不规则，核膜模糊，粗面内质网明显扩张，脱颗粒，空泡变，神经元严重损害，线粒体变大，嵴断裂，减少，甚至消失。醒神解郁汤低剂量组（）、高剂量组（）、舍曲林组大鼠海马神经元
13、超微结构损伤较小，细胞膜较清晰，粗面内质网轻度扩张，线粒体分布均匀，大多轻微肿胀，嵴少量断裂，神经元受损程度明显减轻。见图。各组大鼠强迫游泳不动时间比较 与假手术组相比，其余 组在第、周强迫游泳静止不动时间均显著增加，差异有统计学意义（），其中卒中后抑郁组强迫游泳静止不动时间随着时间的增加而增加，在第 周达到最大值。与卒中后抑郁组相比，醒神解郁汤低剂量组、高剂量组及舍曲林组均在第 周开始用药后强迫游泳静止不动时间出现不同程度地下降，差异有统计学意义（）。与舍曲林组相比，醒神解郁汤低剂量组、高剂量组在第、周强迫游泳静止不动时间差异有统计学意义（）。醒神解郁汤低剂量组、高剂量两两比较，强迫游泳静止
14、不动时间在第、周差异均无统计学意义（）。见表。图 电镜下海马超微组织结构表 各组大鼠强迫游泳静止不动时间（）组别只数（只）第 周强迫游泳静止不动时间（）第 周强迫游泳静止不动时间（）第 周强迫游泳静止不动时间（）第 周强迫游泳静止不动时间（）第 周强迫游泳静止不动时间（）正常组 卒中后抑郁组 醒神解郁汤低剂量组 醒神解郁汤高剂量组 舍曲林组 注：与正常组同期比较，；与卒中后抑郁组同期比较，。老年医学与保健 年第 卷第 期 ，各组大鼠海马体组织 比值比较 与假手术组相比，组大鼠海马体组织 比值显著升高，差异有统计学意义（.）；与 组相比，醒神解郁汤低剂量、高剂量组、舍曲林组大鼠在 比值明显降低，
15、且醒神解郁汤低剂量组 比值下降更显著，差异有统计学意义（）；与舍曲林组相比，醒神解郁汤低剂量组、高剂量组 比值差异无统计学意义（）。醒神解郁汤低剂量组、高剂量两两比较，醒神解郁汤低剂量组大鼠 比值差异无统计学意义（.）。见表。表 各组大鼠海马体组织 比值比较（）组别只数（只）假手术组 卒中后抑郁组 醒神解郁汤低剂量组 醒神解郁汤高剂量组 舍曲林组 注：与假手术组同期比较，；与卒中后抑郁组同期比较，。注：为假手术组，为卒中后抑郁组，为醒神解郁汤低剂量组，为醒神解郁汤高剂量组，为舍曲林组。图 各组大海马体组织 胶像图 各组大鼠血清 水平比较与假手术组相比，卒中后抑郁组血清 水平明显增高，差异有统计
16、学意义（）。与卒中后抑郁组相比，醒神解郁汤低、高剂量组及舍曲林组经治疗后血清 水平均不同程度地降低，其中醒神解郁汤低剂量组 水平下降更明显。醒神解郁汤低剂量组与卒中后抑郁组相比差异有统计学意义（）。醒神解郁汤低剂量组、高剂量组两两比较，差异无统计学意义（.）。见表。表 各组大鼠血清 水平比较（，）组别只数（只）假手术组 卒中后抑郁组 醒神解郁汤低剂量组 醒神解郁汤高剂量组 舍曲林组 注：与假手术组同期比较，；与卒中后抑郁组同期比较，。讨论 卒中后抑郁属中医学郁证与中风之合病，就其因果关系而言，郁证为中风之变证，系“因病而郁”。中医虽无卒中后抑郁之病名，但其忧思多虑核心症状跟抑郁相同，属中医“郁病”范畴，为七情之一。中风日久，脑损神戚，认知改变，加之康复缓慢，促使产生抑郁。现有的治疗抑郁症的药物如舍曲林等，以抑制神经递质再摄取，提高神经递质的浓度为治疗靶点，并能改善自主神经功能，降低交感神经的活性以改善抑郁症状。但临床应用中发现舍曲林存在胃肠道不适、性功能障碍、心脏毒性等不良反应，且不适于长期服用。因此开发疗效确切、不良反应小的中药复方有重要意义。本课题组在前期研究的基础上，认为本病病位