1、第 42 卷 第 12 期2022 年 12 月Vol.42 NO.12DEC.2022赣南医学院学报JOURNAL OF GANNAN MEDICAL UNIVERSITY投稿网址：http：/血清甘胆酸、甲胎蛋白联合乙型肝炎病毒前C区/BCP区突变检测在肝细胞肝癌中的临床价值赖蜜，胡蝶，王晓玲，钟田雨（赣南医学院第一附属医院检验科，江西 赣州 341000）摘 要：目的：探讨血清甘胆酸、甲胎蛋白（-fetoprotein，AFP）和乙型肝炎病毒前C区/BCP区突变的关系及对肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）诊断的意义。方法：收集2020年12月2022年
2、2月在我院诊疗的HCC患者200例，分为乙肝肝癌组（100例）和非乙肝肝癌组（100例）。采用免疫比浊法检测血清甘胆酸、双抗体夹心法检测血清AFP、PCR-反向点杂交法检测HBV前C区/BCP区突变，通过SPSS 22.0软件进行联合分析。结果：乙肝肝癌组的血清AFP水平显著高于非乙肝肝癌组的血清AFP（P0.05）；在乙肝肝癌组中，HBV基因突变组血清AFP高于HBV基因未突变组（P0.05），其中BCP区突变组AFP水平高于BCP区未突变组（P0.05）。结论：血清AFP水平与HCC类型和HBV突变类型有潜在相关性，对HCC的发病机制了解和诊断有重大参考价值。关键词：肝细胞肝癌；甘胆酸；甲
3、胎蛋白；乙型肝炎病毒前C区/BCP区突变中图分类号：R735.7，R446.62 文献标志码：A 文章编号：1001-5779（2022）12-1227-05 DOI:10.3969/j.issn.1001-5779.2022.12.001开放科学（资源服务）标识码（OSID）：Clinical value of serum cholyglycine，AFP combined with mutation detection of hepatitis B virus pre-C region/BCP region in HCCLAI Mi，HU Die，WANG Xiao-ling，ZHONG
4、Tian-yu（Laboratory Department，The First Affiliated Hospital of Gannan Medical University，Ganzhou，Jiangxi 341000）Abstract :Objective :To explore the relationship between cholyglycine，AFP and mutations in the pre-C region/BCP region of hepatitis B virus，and its significance in the diagnosis of hepatoc
5、ellular carcinoma（HCC）.Methods :From December 2020 to February 2022，a total of 200 cases with HCC in our hospital were divided into hepatitis B group（100 cases）and non-hepatitis B group（100 cases）.Immunoturbidimetric method was used to detect cholyglycine，double anti-body sandwich method to detect A
6、FP，PCR-reverse dot blot to detect the mutation of HBV pre-C region/BCP region，and SPSS 22.0 software was used for conjoint analysis.Results :The AFP level in the hepatitis B group was significantly higher than that in the non-hepatitis B group（P0.05）.Among the hepatitis B group，the AFP of the HBV mu
7、tation group was higher than that of the non-mutated group（P0.05），and the level of AFP in the mutant group was higher than that in the non-mutated group in the former C region（P0.05）.Conclusion :AFP has potential correlations with HCC types and HBV mutation types，and has great reference value for un
8、derstanding and diagnosing the disease.Key words :Hepatocellular carcinoma；Cholyglycine；-fetoprotein；HBV C region/BCP region mutation肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是我国常见恶性肿瘤之一，也是第三大癌症死亡原因1。HCC的高致死率与 HCC的高恶性程度和发病隐匿有关，大部分患者确诊时已为晚期，错过了基金项目：国家自然科学基金项目（82260422）；江西省卫生健康委员会科技计划项目（202130700）；赣州市指导性科技计划
9、项目（GZ2019ZSF036）；赣南医学院第一附属医院院级科技计划项目（YJYB202075）作者简介：赖蜜，女，本科，讲师，主管技师，研究方向：生物化学。E-mail：通信作者：钟田雨，男，博士，教授，主任医师，硕士生导师，研究方向：疾病诊断和预后的分子标志物。E-mail： 12272022 年赣 南 医 学 院 学 报投稿网址：http：/最佳治疗时机。目前，HCC的诊断依赖于血清学检查、影像学检查和病理学检查，但都无法对早期HCC进行诊断。甲胎蛋白（-fetoprotein，AFP）是一种针对肝癌的肿瘤标记物，临床上被广泛用于肝癌的辅助诊断和术后复发的监测2。但是AFP的检测也被证明
10、缺乏灵敏性和特异性，多达40%的HCC患者血清AFP处于正常水平，尤其多见于早期HCC患者3。然而在一些慢性乙型肝炎和肝硬化患者上又见显著升高4-5。肝脏作为人体重要的代谢器官，组织代谢组学方法是研究肝癌代谢异常的重要手段。甘胆酸是胆酸与甘氨酸结合形成的一种结合型胆酸，甘胆酸作为肝脏代谢产物，其水平可以动态反映肝脏损伤过程。相比较谷丙转氨酶、谷草转氨酶等常规肝功能检测指标，甘胆酸更敏感且能对早期肝炎、肝硬化进行疗效评估和早期诊断6。一项百人的队列研究表明，HCC患者血清甘胆酸水平显著高于健康人群7。因此，甘胆酸在监测和诊断HCC方面具有潜在价值。据估计，全球约有47%肝细胞癌病例发生在中国，其
11、中70%的HCC患者为乙肝相关性HCC8-9。乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）DNA的变异被认为是HCC的危险因素。由于HBV逆转录酶缺乏校对功能，HBV DNA容易出现突变，且突变率是其他 DNA 病毒的 10 倍10-11。其中与 HCC 相关的BCP 区（Basal core promoter，BCP）和前 C 区（Pre-core，C）的突变最为常见。HBV BCP区主要突变包括A1762T/G1764A。研究表明，这种双突变可提高HBV的复制率12。多项队列研究表明，BCP双突变与HCC进展具有紧密相关性13-14。伴随BCP区双突变的乙肝携带者在术后也更容
12、易发生转移15。HBV前C区常见G1896A突变，其突变也与HBV的复制程度相关16。前 C区突变多见于慢性乙肝患者，其突变造成终止密码子形成，影响HBeAg的表达并引起HBV免疫逃逸17。这对疾病判断和疾病干预带来严峻挑战。因此，准确判断HBV是否突变及突变类型对肝癌诊断、治疗和预后具有重要意义。目前，已有大量关于单独甘胆酸、AFP和乙型肝炎病毒前C区/BCP区突变在HCC诊断中的意义的研究。但很少有关于三者潜在联系在HCC诊断的报道。本研究收集了200例肝癌患者，包括100例乙肝肝癌患者和100例非乙肝肝癌患者。通过对血清甘胆酸、AFP和乙型肝炎病毒前C区/BCP区突变的联合检测，探讨甘胆
13、酸、AFP和乙型肝炎病毒前C区/BCP区突变在HCC之间的关联，以及三者联合检测在HCC临床诊断中的价值。1 材料和方法 1.1研究对象 选取2020年12月2022年2月在本院就诊的HCC患者血清200例，其中100例肝细胞癌患者经化学发光法检测HBV病毒表面抗原阳性（HBsAg0.05 IU mL-1），100 例 肝 细 胞 癌 患 者HBV 病毒表面抗原阴性（HBsAg0.05 IU mL-1）。将200例患者分为乙肝肝癌组和非乙肝肝癌组。1.2纳入和排除标准 纳入标准：HCC患者均经影像学和病理学诊断明确，符合 原发性肝癌的临床诊断与分期标准18。患者及其家属对此次研究内容知情并签署
14、知情同意书。排除标准：（1）患者合并其他恶性肿瘤；（2）患者有严重凝血功能障碍。1.3仪器与试剂 1.3.1仪器迈瑞 BS-820M 生化仪、罗氏 Elecsys e602全自动电化学发光仪，ABI2720PCR扩增仪。1.3.2试剂甘胆酸试剂盒购于美康生物科技有限公司，AFP试剂盒购于罗氏制药有限公司，乙型肝炎病毒前C区/BCP区突变检测试剂购于达安基因有限公司。1.4检测方法 1.4.1血清甘胆酸的检测取入组患者外周血35 mL，收集于含分离胶的真空采血管中。接收样本后，放入离心机1 600 g离心10 min及时分离血清用于后续项目检测或70 保存待检。使用迈瑞BS-820M生化仪，在质
15、控标准下按照说明书进行操作。检测方法为胶乳增强免疫比浊法，检测线性范围为0.580 mg L-1。1.4.2血清AFP的检测收集入组患者血清，使用罗氏Elecsys e602全自动电化学发光仪，在质控标准下按照说明书进行操作。检测方法为电化学发光法，检测范围0.51 000 ng mL-1。1.4.3乙型肝炎病毒前C区/BCP区突变检测按照 说 明 书 操 作 取 入 组 患 者 血 浆，加 入 引 物 在ABI2720 中进行 PCR 扩增，按比例（HBV preC/BCP突变PCR反应液42 L/人份+HBV preC/BCP突变酶系3 L/人份）取相应量的PCR反应液及酶系，充分混匀后按
16、45 L/管分装至0.2 mL离心管中，然后分别取处理后样品、阳阴性质控品5 L，加入到0.2 mL 122812 期赖蜜，等 血清甘胆酸、甲胎蛋白联合乙型肝炎病毒前C区/BCP区突变检测在肝细胞肝癌中的临床价值投稿网址：http：/离心管中，6 000 rpm 瞬时（3 s）离心，将各反应管放入PCR仪。50 3 min；93 5 min；（93 30 s54 45 s72 30 s）45 个循环，最后 72 保温7 min后再进行杂交显色。杂交显色具体步骤如下：杂交液与杂交液预热至42，备用；杂交液（完全浸没膜条），备用；将PCR产物加入对应的杂交显色液离心管中，使得膜条在杂交过程中低速转动（100150 转 min-1），杂交45 min；放入水浴水槽（42），100 转 min-1，水浴 5 min，弃杂交液。加入20 mL结合液，放置于2030 脱色摇床上摇摆（3050 转 min-1），避光反应10 min。弃结合液，弃杂交液。再将50 mL离心管倒置于吸水纸上，吸干管底液体。加入相应量的显色液，避光反应510 min；当显色弱时，可适当延长显色时间。显色反应结束后，立即弃