1、第 32 卷第 2 期Vol.32，No.2131-1392023 年 2 月草业学报ACTA PRATACULTURAE SINICA张涛，牟英玉，亓王盼，等.亚急性瘤胃酸中毒耐受性不同的奶牛瘤胃上皮形态及功能差异研究.草业学报，2023，32（2）：131139.ZHANG Tao，MU Ying-yu，QI Wang-pan，et al.Comparison of rumen epithelium morphology and function in dairy cows with differences insusceptibility for subacute ruminal aci
2、dosis.Acta Prataculturae Sinica，2023，32（2）：131139.亚急性瘤胃酸中毒耐受性不同的奶牛瘤胃上皮形态及功能差异研究张涛，牟英玉，亓王盼，张继友，毛胜勇*（南京农业大学消化道微生物研究室，反刍动物与营养饲料工程中心，动物科技学院，江苏 南京 210095）摘要：本试验旨在探究 SARA（亚急性瘤胃酸中毒）耐受性不同奶牛的瘤胃上皮形态及其功能差异。选取 12头装有永久性瘤胃瘘管的泌乳中期荷斯坦奶牛，饲喂精粗比为 4 6 的日粮，并根据瘤胃 pH 值的高低，分为 SARA 易感组（SUS，n=4）和 SARA 耐受组（TOL，n=4）。瘤胃上皮形态及功能分
3、析结果显示，与 TOL组比较，SUS组奶牛瘤胃上皮的棘突层和基底层厚度明显增厚（P0.05），SUS 组奶牛瘤胃上皮组织中参与挥发性脂肪酸（VFA）吸收的PAT1、MCT4和 DRA基因表达量较 TOL组显著下调（P0.05），而 H+转运载体 NHE1、NHE2、NHE3和调节胞内pH的 vH+ATPase和 Na+/K+ATPase的表达量显著升高（P0.05）；对参与调控瘤胃 VFA代谢的基因定量结果表明，SUS组 PDHA1和 SREBP2的表达量显著高于 TOL组（P0.05），而 HMGCL-2的表达量显著降低（P0.05）；此外，SUS组 CDK2、CDK6和 Cyclin D1
4、、Bad及 Caspase-9等参与瘤胃上皮细胞增殖与凋亡的基因表达量显著高于TOL 组（P0.05）。结果说明，在相同日粮条件下，SUS 组奶牛瘤胃上皮细胞调控游离脂肪酸吸收的基因表达量下调，造成瘤胃上皮对 VFA 的吸收能力下降，使得瘤胃内 VFA 累积和 pH 下降，并导致 SUS 组奶牛 SARA 的患病风险增高。关键词：奶牛；亚急性瘤胃酸中毒；耐受性；瘤胃上皮Comparison of rumen epithelium morphology and function in dairy cows withdifferences in susceptibility for subacut
5、e ruminal acidosisZHANG Tao，MU Ying-yu，QI Wang-pan，ZHANG Ji-you，MAO Sheng-yong*Laboratory of Gastrointestinal Microbiology，Ruminant Nutrition and Feed Engineering Center，College of Animal Science andTechnology，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，ChinaAbstract：This experiment was conducted
6、 to compare the morphology and function of rumen epithelium in dairy cowswith differences in susceptibility to subacute ruminal acidosis（SARA）.Twelve multiparous fistulated Holstein cowsin mid lactation were housed in individual stalls and fed a diet with a concentrate to forage ratio of 4 6 through
7、out theexperimental period.Based on the ruminal pH，cows with relatively lower and higher mean ruminal pH wereassigned，respectively，to susceptible（SUS，n=4）and tolerant（TOL，n=4）groups.The examination of ruminalepithelial morphology and function revealed that the cells in the spinous process and basal
8、layer of ruminal epitheliumwere thicker in the SUS than in the TOL group（P0.05）.In the SUS group，the expression levels of PAT1，MCT4，and DRA genes involved in volatile fatty acid（VFA）absorption were significantly lower（P0.05），whileDOI：10.11686/cyxb2022065http：/收稿日期：2022-02-14；改回日期：2022-04-20基金项目：国家自然
9、科学基金项目（32072755）资助。作者简介：张涛（1994-），男，湖南邵阳人，在读硕士。E-mial： 通信作者 Corresponding author.E-mail：Vol.32，No.2ACTA PRATACULTURAE SINICA（2023）the NHE1，NHE2，NHE3，vH+ATPase，and Na+/K+ATPase levels were significantly higher than in the TOLgroup（P0.05）.The results of gene expression for ruminal VFA metabolism showe
10、d that PDHA1 and SREBP2in the SUS group was higher（P0.05），while the expression of HMGCL-2 was significantly lower（P0.05）.Inaddition，the expression levels of genes involved in the proliferation and apoptosis of rumen epithelial cells，such asCDK2，CDK6，Cyclin D1，Bad and Caspase-9 in the SUS group were
11、higher in the SUS group than in the TOLgroup（P0.05）.In summary，under the same diet，there was a lower expression of genes associated with freefatty acid absorption and a higher expression of genes related to non-free fatty acid absorption in rumen epithelial cellsof SUS cows.This results in free fatt
12、y acid accumulation and reduced ruminal pH in the SUS group，and increasedthe risk of SARA in these cows.Key words：dairy cows；subacute ruminal acidosis；tolerance；rumen epithelium我国是一个优质牧草资源十分匮乏的国家，奶牛生产中，为提高奶牛产奶量，养殖者常给奶牛饲喂高谷物日粮以提高产奶量。然而，奶牛摄入过多的易发酵碳水化合物易导致瘤胃微生物发酵速率加快，产生大量挥发性脂肪酸（volatile fatty acid，VFA）
13、，导致瘤胃内环境酸碱平衡被破坏，引起瘤胃 pH 急剧下降1，继而诱发亚急性瘤胃酸中毒（subacute ruminal acidosis，SARA）等瘤胃疾病2。研究发现，SARA 可引起瘤胃代谢紊乱，诱发皱胃移位、瘤胃炎、乳房炎及蹄叶炎等3-5，给奶牛养殖造成了巨大的经济损失。生产中发现，尽管通过营养配方调整、添加瘤胃缓冲剂或微生物制剂可降低 SARA 的发生率，但奶牛场中仍然存在一定程度 SARA 的发生率，这一现象显示，SARA 的发生除受日粮结构的影响外，还与其他因素有关。此外，近年来研究发现，即便在相同日粮条件下，奶牛发生 SARA 的严重程度也不一致6-8，造成营养配方调整方案实施
14、困难，部分易感个体出现严重的酸中毒现象。这些结果说明，奶牛个体间对 SARA 的易感性存在差异，这种个体差异的存在可能是导致当前营养调控手段不能完全控制奶牛发生 SARA 的根本原因。因此，明确 SARA 耐受不同奶牛的瘤胃生理特征，有利于筛选 SARA 耐受性强的奶牛进行饲养，进而降低牛群患 SARA 的风险，减少蹄叶炎、真胃移位等营养代谢病的发生，从而推进奶牛分群饲养及健康养殖的发展。众所周知，SARA 的发生主要与瘤胃 pH 过低有关，而瘤胃 pH 主要受瘤胃内 VFA 生成和移除速率的影响9-10。因此，瘤胃内 VFA 生成和移除速率差异极有可能是造成 SARA 耐受性不同的关键因素。
15、在瘤胃中，VFA 的移除主要通过瘤胃上皮对 VFA 吸收来实现，而瘤胃上皮对 VFA 的吸收主要与瘤胃上皮形态和功能有关。然而，目前关于不同 SARA易感奶牛的瘤胃上皮形态及其与 VFA吸收相关的功能基因表达差异的研究鲜有报道。由此，本研究拟在相同日粮条件下，以瘤胃 pH 为基准，筛选出对 SARA 耐受性不同的奶牛，结合伊红染色（hematoxylin-eosin staining，HE）切片及实时定量 PCR 等技术手段，比较研究两组奶牛瘤胃上皮组织形态及其功能基因表达差异，以揭示奶牛 SARA耐受性与其瘤胃上皮形态与功能基因表达的潜在关系。1材料与方法1.1试验设计及动物饲养管理本试验于
16、 2019年 2月在江苏泰州天资牧业有限公司开展，选用 12头体重相近且装有永久性瘤胃瘘管的泌乳中期荷斯坦奶牛 23胎，泌乳天数为（11422）d，栓系饲喂，自由采食和饮水。试验期为 35 d，前 14 d为日粮适应期，后 21 d为试验期，奶牛试验期提供精粗比为 4 6的混合饲粮，饲粮配方及营养水平在张涛等11的研究中已详细描述。分别于每天 8：00和 19：00饲喂，剩料量控制在饲喂量的 5%10%，并于饲喂前挤奶。1.2样品采集在试验期第 20和 21天晨饲后的 0、2、4、6、8、12 h测定瘤胃 pH，并于 0、4、8、12 h测定瘤胃 VFA 浓度，随后基于瘤胃 pH 变化，将奶牛进行分组。在第 21天晨饲前，采集人员佩戴一次性灭菌长臂手套，通过瘤胃瘘管触及瘤胃腹囊乳头根部，用手指捏断瘤胃乳头根部，迅速放置培养皿中用冰磷酸盐缓冲溶液（phospate buffered saline，132第 32 卷第 2 期草业学报 2023 年PBS）清洗 3次后，挑选完整上皮乳头置于 4%多聚甲醛溶液中，并置于 4 C 保存，用于瘤胃上皮乳头组织形态学分析；取剩余部分乳头剪碎，于液氮