1、响应面法优化樱桃酵素的发酵工艺及抗氧化活性研究王 缎，崔国庭，刘盈盈（河南科技大学，河南 洛阳 471003）摘 要：目的 研究樱桃酵素的发酵工艺和部分生物活性。方法 以超氧化物歧化酶（SOD）活性为响应值，采用单因素实验和Box-Behnken响应面设计优化樱桃酵素的发酵工艺，进一步测定樱桃酵素OH、DPPHO2清除能力和还原力等体外抗氧化能力，及SOD、脂肪酶和淀粉酶的活性。结果 采用酵母菌接种量1.1%、29条件下发酵12 h，获得樱桃酵素含有大量的SOD和少量的脂肪酶和淀粉酶，其中SOD活性最高可达40.76 U/ml；樱桃酵素DPPH自由基清除率最高可达91.45%，OH清除率和O2
2、清除率初期达77.67%和75.04%，还原力为0.349，樱桃酵素的抗氧化活性随贮藏时间延长呈下降趋势。结论 本研究通过优化樱桃酵素的发酵工艺，并研究其抗氧化活性和酶活性，为樱桃的精深加工和综合开发利用提供了技术参考。关键词：樱桃酵素；Box-Behnken；抗氧化；超氧化物歧化酶中图分类号：TS255.3 TQ925 文献标识码：A 文章编号：1672-979X（2023）01-0013-05DOI：10.3969/j.issn.1672-979X.2023.01.003Optimization of Fermentation Technology and Antioxidant Acti
3、vity of Cherry Enzyme by Response Surface MethodologyWANG Duan,CUI Guo-ting,LIU Ying-ying（Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China）Abstract:Objective To study the fermentation technology of cherry enzyme and some biological activities of cherry enzyme.Methods Using SOD activit
4、y as the response value,the fermentation process of cherry enzyme was optimized by single factor experiment and Box-Behnken response surface design.The scavenging ability and reducing power of OH,DPPH and O2were further determined,as well as the activities of SOD,lipase and amylase in vitro.Results
5、The cherry enzyme containing a large amount of SOD and a small amount of lipase and amylase were obtained by using 1.1%yeast inoculation and fermentation at 29 for 12 h.The highest activity of SOD was 40.76 U/ml.The maximum DPPH free radical scavenging rate was 91.45%,the OH and O2scavenging rate wa
6、s 77.67%and 75.4%at the initial stage,and the reducing power was 0.349.With the extension of storage time,the antioxidant activity of cherry enzyme decreased.Conclusion In this study,the fermentation process of cherry enzyme was optimized,and its antioxidant activity and enzyme activity were studied
7、,which can provide technical reference for the intensive processing,comprehensive development and utilization of cherry.Key Words:cherry enzyme;Box-Behnken;antioxidant activity;SOD收稿日期：2021-12-14作者简介：王缎，硕士，研究方向为果蔬加工，E-mail:樱桃果实色泽鲜艳、酸甜可口、营养丰富，含有多种维生素和矿物元素，还有酚类、花色苷、黄酮、褪黑素（N-乙酰-5-甲氧基色胺）、谷胱甘肽和番茄红素等生物活性物
8、质1-3。樱桃所含的生物活性成分能清除机体中的过量自由基，保护机体免受自由基伤害，有促进血液循环、抗氧化、健脑益气、抗病毒等多种生理功效，具有很高的营养价值和食疗作用4-5。由于樱桃含水量高、果皮薄，采收期正值高温季节，采后呼吸旺盛、不耐贮运，易受机械损伤和微生物侵染而腐烂变质，造成经济损食品与药品 Food and Drug 2023年第25卷第1期 13失6，成为限制樱桃产业大规模发展的瓶颈。因此，樱桃产品的深加工是解决目前樱桃产业困境的方法之一。目前，国内外常见的樱桃加工产品有樱桃罐头7、果酒8、果汁9、果醋10、果脯11、果酱12等。食用植物酵素是以植物为原料，经微生物发酵制得含有特定
9、生物活性成分的可食用的酵素产品，2017年中国生物发酵产业协会发布食用植物酵素标准13，2018年轻工业部颁布植物酵素的行业标准，明确了食用植物酵素的概念、感官标准和特征指标14。研究表明，植物酵素含有多种生物活性成分，如淀粉酶、脂肪酶、超氧化物歧化酶（SOD）等大分子物质，多酚类化合物、有机酸、-氨基丁酸、游离氨基酸等小分子化合物，具有抗氧化、抗衰老、增强身体免疫力等保健功能15-16。将樱桃制成樱桃酵素，是樱桃深加工过程中最有潜力的加工方式之一，不仅延长了樱桃产品的货架期，也提升了樱桃的附加值。本文以樱桃为原料，优化樱桃酵素的发酵工艺，并测定樱桃酵素的体外抗氧化能力和主要酶的生物活性，为樱
10、桃酵素的进一步综合性开发、工业化生产和生物功能机制研究提供新的思路和理论基础。1 材料与方法1.1 材料与仪器樱桃、酵母（安琪酵母）（洛阳市大张超市）。乙二胺四乙酸（EDTA）、氯化钠Tris、邻苯三酚、氢氧化钠、可溶性淀粉、聚乙烯醇、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、水杨酸钠、硫酸亚铁、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、三羟甲基氨基甲烷等，试剂均为分析纯。L9Plus 双光束紫外可见分光光度计（上海仪电）；FA224电子天平（上海舜宇恒平）；JC-400A型生化培养箱（青岛精诚）；KH19A台式高性能高速离心机（湖南凯达）；HH-1电热恒温水浴锅（无锡玛瑞特）。1.2 方法1.2.1
11、制备樱桃酵素 挑选无腐烂的樱桃，清洗打浆后，接入0.1%2%酵母菌，于2045 条件下，静置发酵624 h，发酵液过滤，制得樱桃酵素成品。1.2.2 樱桃酵素发酵工艺优化 单因素试验：分别研究酵母菌接种量（0.1%，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%）、发酵时间（6，9，12，15，18，21，24 h）、发酵温度（20，25，30，35，40，45）3种单因素对樱桃酵素中SOD活性的影响。优化试验：在单因素试验基础上，以酵母菌接种量（A）、发酵时间（B）和发酵温度（C）为独立变量，以SOD活性为响应变量，采用Box-Benhnken响应面方法进行优化，获得酵素发酵的最佳工艺条件。因素和水
12、平见表1。表1 Box-Behnken试验设计因素水平因 素编码水平-101A 接种量/%0.511.5B 时间/h61218C 温度/2530351.2.3 酶活性测定 SOD活性参照徐雅娟等17、淀粉酶活性参照宋阳等18、脂肪酶参照董银卯等19方法。1.2.4 超氧阴离子自由基（O2）清除能力测定 参照崔国庭等20方法。1.2.5 羟基自由基（OH）清除除能力测定 参照Xiong等21方法。1.2.6 DPPH清除能力测定 参照Cui等22方法。1.2.7 还原性测定 参照Yen等23方法。1.3 数据处理每组试验进行3 次重复，取其平均值，数据处理和图表绘制采用GraphPad.Pris
13、m 5.0软件，响应面数据分析处理、绘图采用Design-Expert 8.0.6软件。2 结果与分析2.1 单因素试验酵母接种量对樱桃酵素中SOD活性的影响见图1（A）。当酵母接种量0.1%1.0%时，樱桃酵素发酵液中SOD活性与酵母菌接种量呈正相关；当接种量超过1.0%，SOD活性与酵母菌接种量相关性不高；酵母菌接种量为1.0%时，SOD活性最高达31.13 U/ml。发酵时间对樱桃酵素中SOD活性的影响见图1（B）。发酵时间为612 h时，樱桃酵素中SOD活性随发酵时间延长逐步提高；超过12 h，SOD活性与发酵时间呈负相关；发酵时间为12 h时，樱桃酵素中SOD活性最高达33.15 U
14、/ml。发酵温度对樱桃酵素中SOD活性的影响见图114 食品与药品 Food and Drug 2023年第25卷第1期（C）。发酵温度为20至30 时，樱桃酵素中SOD活性随温度升高而提高；升至45 时，SOD活性则呈下降趋势，可能由于发酵温度超出了酵母的最适发酵温度，酵母发酵能力降低导致；发酵温度为30 时，SOD活性达最高35.15 U/ml。因此，综合考虑选择酵母菌接种量为1.0%、发酵时间为12 h、发酵温度为30，在此基础上进一步优化发酵工艺条件。图1 接种量、发酵时间和发酵温度对SOD活性的影响2.2 响应面法优化2.2.1 Box-Behnken 试验设计和模型拟合 根据Box
15、-Behnken 试验设计方案及结果见表2。运用Design expert 8.0.6软件对表2数据进行多元拟合分析，建立二次回归模型，获得酵素中SOD活性与主要因素之间方程式：Y=41.51+1.38A+0.33B-2.26C-1.18AB-0.52AC+0.7BC-4.1A2-4.8B2-9.12C2对模型进行回归方差分析，结果见表3，模型F=56.41、P值 0.05，表明试验误差不显著；R2=0.9864，表明用该模型获得预测值与试验测定数值之间吻合度较高、能准确预测樱桃酵素发酵过程中发酵时间、发酵温度和酵母菌接种量对酵素中SOD活性的影响。由表3可见，一次项A、C和二次项AA、BB和
16、CC的P值均小于0.01，表明发酵时间、发酵温度和酵母菌接种量对SOD活性均有显著的影响；交互项AB、AC和BC的P值0.05，表明它们之间的交互作用影响不显著。表3 方差分析表方差来源 自由度 平方和均方F值P值显著性模型9634.5770.5156.41 0.0001*A115.3515.3512.280.0099*B10.860.860.690.4347 不显著C140.6840.6832.550.0007*AB15.595.594.470.0722 不显著AC11.071.070.860.3854 不显著BC11.951.951.560.2522 不显著AA170.9470.9456.760.0001*BB1979777.61 0.0001*CC1350.57 350.57 280.48 0.0001*残差78.751.25失拟项36.932.315.080.0752 不显著纯误差41.820.45总离差16643.32R20.9864注：*差异极显著（P0.01），下同表2 响应面实验方案与结果实验号ABCY接种量/%发酵时间/h发酵温度/SOD活性/Uml-111-1033