1、基金项目:内蒙古自治区自然科学基金资助项目(2019MS08117)作者单位:010059呼和浩特,内蒙古医科大学(刘一纬);010020呼和浩特,内蒙古医科大学附属人民医院(杨鹏杰、魏起友)通信作者:杨鹏杰,电子信箱:yangpengjie5933264 ;魏起友,电子信箱:weiqiyou2021 小鼠颈部异位心脏移植模型的初步探索刘一纬杨鹏杰魏起友摘要目的探讨初学者使用袖套法建立小鼠颈部异位心脏移植模型的技术要点与难点。方法第 1 阶段选用 C57BL/6小鼠随机分为供、受体,完成手术建模。术后供心复跳,小鼠活动正常,持续 3 天以上视为手术成功,3 天内供心停跳或小鼠死亡视为手术失败,
2、记录失败原因。第 2 阶段分为同系组(C57BL/6 小鼠为供、受体)与模型组(BALB/c 小鼠为供体、C57BL/6 小鼠为受体),术后每天观察供心活动状态记录移植物存活时间(n=9);术后第 7 天移植心脏取材固定,HE 染色,记录供心排斥反应病理分级(n=9)。结果第 1 阶段解决了麻醉意外、手术操作不当、血管套管外翻失败、供心结扎口出血、静脉连接处淤血、环境温度过低和术后感染等问题后成功建模;第 2 阶段模型组较同系组移植物生存期明显缩短(P 0.01),排斥反应病理分级显著升高(P 0.01),模型组移植物心肌细胞损伤、间质水肿、出血,大量炎性细胞浸润,呈中到重度急性排斥反应表现。
3、结论使用袖套法建立小鼠颈部异位心脏移植模型,省去了血管吻合这一技术难点,大大降低手术难度,其中 0.4mm 0.5mm、0.8mm 1.0mm 套管的选用值得推广与学习。关键词心脏移植同种异体移植动物模型cuff 技术中图分类号R617文献标识码ADOI 10.11969/j.issn.1673-548X.2023.02.014Preliminary Exploration of Mouse Cervical Heterotopic Heart Transplantation Model.LIU Yiwei,YANG Pengjie,WEI Qiyou.InnerMongolia Medica
4、l University,Inner Mongolia 010059,ChinaAbstractObjectiveTo explore the technical points and difficulties of establishing a mouse cervical heterotopic heart transplanta-tion model using the cuff method for beginners.MethodsIn the first stage,C57BL/6mice were randomly divided into donors and recipi-e
5、nts,and the surgical model was completed.After the operation,the heart rebeated,and the mouse activity was normal for more than 3das the operation was successful,and the mouse heart stopped beating or died within 3d as the operation failure,and the reason for the fail-ure was recorded.In the second
6、stage,the mice were divided into the syngeneic group(C57BL/6mice as donor and recipient)and themodel group(BALB/c mice as donors and C57BL/6mice as recipient).The activity state of the donor heart was observed every day afteroperation and the survival time of the graft was recorded(n=9).On the 7th d
7、ay after operation,the transplanted hearts were sampledand fixed,stained with hematoxylin-eosin,and the pathological grade of the donor heart rejection was recorded(n=9).ResultsInthe first stage,the modeling was completed after solving the problems of anesthesia accident,improper operation,failure o
8、f vascular can-nula eversion,bleeding at the ligation port of the donor heart,congestion at the venous junction,low ambient temperature and postopera-tive infection.In the second stage,the graft survival time of the model group was significantly shorter than that in the syngeneic group(P 0.01),and t
9、he pathological grade of rejection reaction in the model group was significantly higher than that in the homologous group(P 0.01).The model group showed graft myocardial cell injury,interstitial edema,hemorrhage,and a large number of inflammatorycells infiltration,showing moderate to severe acute re
10、jection.ConclusionThis experiment starts from zero,summarizes experience andtechnical points,and successfully establishes an acute rejection model of allograft transplantation,which provides a complete idea for fu-ture generations to learn and is worthy of promotion.Key wordsHeart transplantation;Al
11、logeneic transplantation;Animal model;Cuff technique器官移植已成为治疗终末期器官衰竭最有效的方法1。2022 年 1 月 7 日,马里兰大学医学院成功完成了一例猪心异种移植2。自 1973 年 Corry 等3首次建立小鼠心脏移植模型以来,如今常用的移植模型分为两种,即腹部心脏移植和颈部心脏移植4 6。颈部解剖结构简单,便于日后观察供体心脏活动状态;颈部创口小,全身反应轻,相比之下腹腔移植创伤大、时间长、感染概率高、肠管粘连可能性大7。在颈部移植模型中,袖套法(cuff 技术)更适用于初学17医学研究杂志 2023 年 2 月第 52 卷第
12、2 期论著者,降低了手术难度,有效减少供心缺血时间8。因此,笔者对小鼠颈部心脏移植模型进行探索,总结建模经验,分析要点难点,为研究移植免疫学打下基础。材料与方法1.材 料:选 用 近 交 系 雄 性 C57BL/6 小 鼠 和BALB/c 小鼠,8 12 周龄,体质量为 20 22g,购自内蒙古医科大学实验动物中心,并于内蒙古医科大学实验动物中心饲养,环境符合 SPF 级标准,实验动物生产许可证号:SCXK(蒙)2020-0001,实验动物使用许可证号:SYXK(蒙)2020-0003。单人双目体视显微镜购自深圳奥斯微光学仪器有限公司;显微手术器械购自上海医疗器械有限公司手术器械厂;4-0 非
13、吸收缝线购自扬州富达医疗器械有限公司;10-0 带针缝合 线 购 自 宁 波 医 用 缝 针 有 限 公 司;0.3mm 0.6mm、0.6mm 0.8mm 四氟毛细管购自上海俊隆装饰工程有限公司;0.4mm 0.5mm、0.8mm 1.0mm硬塑料毛细管购自南通伊诺精密塑胶导管有限公司;水合氯醛、HE 染液试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司;肝素钠注射液购自天津生物化学制药有限公司;4%多聚甲醛固定液购自福州白鲸生物科技有限公司。2.供 体 手 术:小 鼠 麻 醉(采 用 5%水 合 氯 醛0.07ml/10g 腹腔注射)、备皮、固定、消毒、铺单,沿腹正中线剪开皮肤、肌肉,推开肠管找出下腔静脉
14、。下腔静脉注射预冷(4)的肝素盐水(100U/ml)1ml,等待 1min 后小鼠全身血液肝素化,剪断下腔静脉和腹主动脉放血。向上剪开膈肌,沿两侧腋中线剪断肋骨,成倒“U”型打开胸腔暴露心脏,撕开心包膜使用冰盐水(4 0.9%氯化钠溶液)滴注小鼠心脏,心跳逐渐缓慢至暂停。分离主动脉、肺动脉并于远心端分叉处剪断,使用 10-0 缝合线将上下腔静脉、肺静脉、左心耳集束结扎后剪去相应血管及组织,取下供心放置于 4 0.9%氯化钠溶液中保存。受体手术:小鼠麻醉(采用 5%水合氯醛 0.07ml/10g 腹腔注射)、备皮、固定、消毒、铺单,沿右锁骨中线向上、下方切开颈部皮肤,上至小鼠下颌骨,下至锁骨下
15、0.5cm,暴露下颌腺并摘除。分离脂肪组织,游离颈外静脉,于颈外静脉远心端分叉处用 10-0 缝合线结扎,近心端分离至锁骨上方,用 10-0 缝合线打活结备用。去除胸锁乳突肌,游离颈总动脉于远心端分叉处用 10-0 缝合线结扎,近心端使用微型动脉夹夹闭血流。分别于远心端结扎处剪断颈动、静脉,将血管断端从备好的套管内部穿过,张开血管壁向外翻转使其完全包裹套管,成功后用 10-0 缝合线结扎固定,使用肝素盐水(100U/ml)冲洗血管套管端口预防血栓形成(图 1)。图 1血管套管外翻过程A.血管穿过套管;B.血管壁外翻;C.血管套管结扎连接与术后:在受体颈动、静脉血管套管下方放置 10-0 缝合线
16、。将供心移至受体颈部,张开供心肺动脉断端完全包裹受体颈静脉套管端口,使血管套管进入肺动脉内,用预埋的 10-0 缝合线结扎肺动脉和颈静脉完成静脉连接。动脉连接方法与静脉相同,供心主动脉包裹受体颈动脉端口完成套入,结扎连接。血管连接完成后,松开颈静脉根部活结,打开颈动脉根部微型动脉夹,血液流通,供心滴注 37 0.9%氯化钠溶液复温,30 60s 后可见供心复跳并逐渐恢复正常节律,用 4-0 缝线缝合颈部皮肤,伤口常规消毒。若术中出血过多,可皮下注射 37 0.9%氯化钠溶液 0.5 1.0ml 补液,术后将小鼠放置于洁净鼠笼内,25 恒温复苏,30 60min 后小鼠苏醒,正常饮水饲料喂养,每日观察供心活动情况(心率、节律、强度),详见图 2。3.失败原因记录:第 1 阶段为训练阶段,指从零开始(无显微外科基础、无实验动物模型建立经验)至第 1 例模型建立成功(术后供心复跳,小鼠活动正常,持续 3 天以上视为手术成功,3 天内供心停跳或小鼠死亡视为手术失败),统计每例小鼠死亡失败原因。4.分组处理:第 2 阶段将小鼠按品系随机分为同系组和模型组,同系组:C57BL/6 小鼠作为供、受体