1、福建畜牧兽医第45卷第1期2023年11杨朵,李娜.不同血清体积分数对脂肪干细胞成脂分化的影响J.中国组织工程研究,2018,22(17):2669-2673.12张丽娇,马莹聪,岳丽敏,等.不同血清浓度对小鼠肺细胞原代培养的影响J.黑龙江畜牧兽医,2016(21):208-209,298.13李珊珊,党时鹏,张桢烨,等.不同浓度胎牛血清对原代心肌成纤维细胞增殖及分化的影响J.江苏大学学报(医学版),2022,32(3):231-235.14洪小栩,佘清.病毒性疫苗生产用牛血清质控问题的探讨J.中国生物制品学杂志,2009,22(4):421-424.15乔自林,冯玉萍,李明生,等.我国新生牛
2、血清的生产现状J.西北民族大学学报(自然科学版),2009,30(4):43-45.四种方法测定伪狂犬病活疫苗病毒含量的稳定性对比试验黄爱珠兆丰华生物科技（福州）有限公司福州350014摘要分别采用10 mL细胞培养瓶和96孔细胞培养板，采用不同条件培养病毒和不同稀释液稀释病毒，以检测伪狂犬病活疫苗病毒含量和比较结果的稳定性。结果显示，使用A、B、C、D四种方法测定伪狂犬病活疫苗病毒含量，对其稳定性的影响差异不显著；在生产实践中，因其便利性和实用性，采用细胞板测定法逐渐成为生产企业的首选，并有替代细胞瓶测定法的趋势。关键词疫苗病毒含量稳定性文献标识码：A文章编号：1003-4331（2023）
3、01-0005-02Stability comparison of four methods for determining virus content of live pseudorabies vaccineHuang Aizhu（Jofunhwa Biotechnology(Fuzhou)Co.Ltd.,Fuzhou 350014）Abstract 10 mL cell culture flask and 96 well cell culture plate were used respectively to culture the virus under different condit
4、ionsand dilute the virus with different dilutions to detect the virus content of live pseudorabies vaccine and compare the stability of the re-sults.The results showed that there was no significant difference in the stability of live pseudorabies vaccine by using four methods A,B,C and D;In the prod
5、uction practice,because of its convenience and practicality,cell plate assay has gradually become the firstchoice of manufacturers,and there is a trend to replace cell bottle assay.Key words Vaccine Virus content Stability猪伪狂犬病（Pseudorabies，PR）是感染伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）引发的一种感染性强、危害极大的猪急性传染病。猪
6、是伪狂犬病病毒的储存宿主，从外面购入带毒的猪只、种猪长期带毒、不重视免疫和生物安全意识淡薄，大大提高了猪伪狂犬病的病死率。猪伪狂犬病的发病率及临床表现，与猪只日龄、PRV感染量及病毒毒力强弱等因素有关。PRV经猪的呼吸道或口腔入侵机体，引起猪只发病，从患猪的鼻分泌物和唾液中排出病毒，通过气溶胶传播或经猪的乳汁、精液、胎盘和阴道黏膜传播，是阻碍我国养猪业健康高质量发展的重大传染病之一。在临床生产中，良好的生物安全措施是前提，科学的饲养管理是基础，免疫接种猪伪狂犬病活疫苗是预防和控制猪伪狂犬病的重要措施。为研究、测定伪狂犬病活疫苗中的病毒含量，本试验将其放置于96孔细胞培养板和10 mL细胞培养瓶
7、中，通过比较细胞板、细胞瓶在不同条件下的培养结果，评估四种测定方法的稳定性与差异性。1材料与方法1.1试验材料1.1.1样品伪狂犬病活疫苗10批，由兆丰华生物科技（福州）有限公司生产提供。1.1.2细胞使用本公司伪狂犬病抗原组制备的细胞液，即将SPF种蛋（由山东斯帕法斯生物技术有限公司提供）孵化后，取911日龄鸡胚制备而成。1.1.3细胞培养容器96孔细胞培养板、10 mL玻璃细胞瓶。1.1.4试剂Earles液、乳汉液、汉氏液、PBS溶液由本公司自行配制；DMEM培养基源自Gibco公司；血清由兰州荣晔生物技术有限公司生产提供。1.2试验设计将试验分为A、B、C、D四组，见表1。1.3试验方
8、法1.3.1制作细胞板在96孔细胞板中，每孔加入0.1 mL自制细胞液，制作2个细胞板；置37、CO2培养箱中培养24 h，使细胞生长良好，直至长成均5福建畜牧兽医第45卷第1期2023年表1试验分组与设计组别细胞培养容器稀释液吸附培养条件ABCD培养板培养板培养瓶培养瓶细胞维持液PBS溶液细胞维持液PBS溶液不吸附置37 吸附1 h，再加入0.1 mL维持液不吸附置37 吸附1 h，再加入0.9 mL维持液37、CO2培养箱37、CO2培养箱37 培养箱37 培养箱匀单层。1.3.2制备细胞瓶在10 mL玻璃细胞瓶中，每瓶装入1 mL细胞液，需制备28个细胞瓶；置37 温箱中培养24 h，使
9、细胞生长良好，直至长成均匀单层。1.3.3样品稀释把样品稀释至1头份/mL后，将稀释液以10倍比进行稀释，使其稀释至10-6。每组采用的稀释液见表1。1.3.4接种细胞培养板首先倒掉已长成单层细胞的细胞板生长液，然后取10-4、10-5、10-6等三个不同的稀释度，每个稀释度各接种细胞板上的4个孔，每孔各0.1 mL。1.3.5接种细胞培养瓶首先倒掉原细胞瓶上的生长液，然后取10-4、10-5、10-6等不同倍次稀释度，每个稀释度接种4个细胞小瓶，每瓶各0.1 mL。2结果与分析根据Reed-Muench法计算TCID50，结果见表2。不同方法对测定伪狂犬病活疫苗病毒含量的稳定性没有影响，组间
10、差异不显著。即：（1）通过细胞培养板进行伪狂犬病病毒含量测定，用细胞维持液稀释和用PBS溶液稀释差异不明显，即A组与B组差异不显著；通过细胞培养瓶进行伪狂犬病病毒含量测定，用细胞维持液稀释和用PBS溶液稀释差异不明显，即C组与D组差异不明显。（2）使用细胞维持液稀释病毒，细胞培养板测定法与细胞培养瓶测定法比较，差异不显著；使用PBS溶液稀释病毒，细胞培养板测定法与细胞培养瓶测定法比较，差异不显著。3讨论与小结依据 中华人民共和国兽药典 的有关规定，2020年以前，采用细胞培养瓶来测定伪狂犬病病活疫苗的病毒含量。但在实际生产检验中，发现偶有不稳定情况出现，而且细胞培养瓶主要以玻璃瓶为主，加上10
11、 mL玻璃瓶本身很小，存在破损率高、清洁不彻底、耗时耗工、检验时因瓶口小易造成污染等缺点；随着细胞培养板的普及应用以及2020版中国兽药典的颁布实施1，用细胞培养板进行病毒含量测定也将得到广泛应用，其相较于细胞培养瓶显得更为简便，加上是一次性耗材，不受清洁度、准备材料、灭菌时间等因素影响，更为实用2。研究发现，使用PBS溶液稀释病毒与使用细胞维持液稀释病毒，两种方法的差异性不显著；通过细胞培养板测定伪狂犬病病毒，相较于采用细胞培养瓶测定伪狂犬病病毒，差异亦不显著。所以，4种方法都可以运用，且不同方法对测定结果的稳定性影响差异不显著。在4种方法中，最便捷、最好用的是A组，即用维持液作为稀释液及细
12、胞培养板培养，B组次之，C组第三，D组最为繁琐、实用性较前三种差。在生产过程中，A方法更为实用，可以大大节约劳动强度和劳动时间；因B、D两种方法为国家标准，因此，仍然是企业成品放行的前提条件，质检部门仍采用该两种方法进行检验。综合考虑稳定性、便捷性、实用性等因素，采用细胞板来测定伪狂犬病活疫苗的病毒含量将成为企业首选，并将逐渐替代传统的细胞培养瓶测定法。试验过程中笔者也发现，不同货号的同一类培养基也会影响病毒含量测定结果的稳定性。所以，应选择适用的培养基，并针对病毒本身的特性，调整适合的pH值。参考文献：1中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典三部（生物制品）M.2020年版.北京:中国农业出
13、版社,2020(附录):64.2陈景容,陈昇生,赵华娥.不同方法测定伪狂犬病活疫苗病毒含量的对比试验J.福建畜牧兽医,2011,33(2):22-23.批号病毒含量（TCID50/头份）A组B组C组D组2020059202006820210022021004202101120210132021015202102220210332021037105.7105.7105.7106.0105.7106.0105.7105.7105.7105.7105.7105.7105.7106.3105.7105.7105.7105.7105.5105.7105.7105.7105.7106.0105.7105.7105.5105.5105.5105.7105.5105.7105.7106.3105.5105.7105.7105.5105.7105.7表210批疫苗测定结果6