1、研究报告2023 年第49 卷第5 期(总第473 期)1DOI:10 13995/j cnki 11 1802/ts 031941引用格式:徐寒冰，郁书怀 双果糖酐水解酶分子改造提升酶活性研究 J 食品与发酵工业，2023，49(5):1 8 XU Hanbing，YUShuhuai Molecular modification of difructose anhydride hydrolase to improve its enzymatic activity J Food and FermentationIndustries，2023，49(5):1 8双果糖酐水解酶分子改造提升酶活性研
2、究徐寒冰，郁书怀*(江南大学 食品学院，江苏 无锡，214122)摘要双果糖酐水解酶(difructose anhydride hydrolase，DFA-ase)能将新型功能甜味剂双果糖酐转化为益生元菊二糖，然而 DFA-ase 酶活性较低，为了提高 DFA-ase 酶法合成菊二糖的能力，该研究对来源于Arthrobacter chlorophenolicus A6 的双果糖酐水解酶 AcDFA-ase 进行分子改造。基于已有的 AcDFA-ase 的晶体结构，选择酶活性口袋上方 loop 区和活性口袋中的 14 个关键位点进行定点突变，得到 17 种 DFA-ase 突变体。利用 96 孔
3、板作为高通量培养容器，结合 DNS 法快速测定酶活性，初筛得到一个酶活性提高的突变体D380A。用 HPLC 法测定分离纯化出的酶活性，验证结果表明其酶活性有显著提高，酶比活性是 AcDFA-ase的 162 3%。同源建模分析，380 位天冬氨酸突变成丙氨酸后，loop 环区域疏水性增强，保证了催化中心的疏水微环境，提高了酶的催化活性。该研究建立的高通量检测方法为 DFA-ase 的筛选以及菊二糖的大量生产奠定了基础。关键词双果糖酐水解酶;定点突变;96 孔板;高通量筛选;同源建模第一作者:硕士研究生(郁书怀副研究员为通信作者，E-mail:shuhuai jiangnan edu cn)基
4、金项目:国家自然科学基金-青年基金项目(31901630);江苏省基础研究计划(自然科学基金)-青年基金项目(BK20190583);江南大学中央高校基本科研计划-青年基金项目(JUSP12007)收稿日期:2022-04-12，改回日期:2022-05-26菊粉(菊糖)是自然界中资源丰富的功能性低聚果糖，主要存在于菊科类植物中，具有改善肠道微生态，促进益生菌增殖，调节血糖、血脂，改善便秘，促进矿物质的吸收以及减少患癌风险等功能，在乳制品、面制品、肉制品加工中有广泛的应用1。菊糖有多条代谢途径，其中一条途径是利用菊粉外切酶将菊粉分解为果糖2，利用菊粉内切酶将菊糖降解为菊粉型低聚果糖3。菊粉型低
5、聚果糖是不同聚合度的低聚果糖的混合物，如菊二糖(果果二糖)、菊三糖(果果三糖)、菊四糖(果果四糖)、菊五糖(果果五糖)、蔗果三糖、蔗果四糖和少量果糖，可发挥益生元作用，可较好地改善妊娠期的糖脂代谢，促进矿物质吸收，调节体内菌群平衡以及增强机体免疫力3 6。另一条途径是利用菊糖果糖转移酶(inulin fructotransferase，IFTase)降解菊糖为双果糖酐(difructose anhydride，DFA)，菊糖可被三型菊糖果糖转移酶(DFA-forminginulin fructotransferase，IFTase-，EC 4 2 2 18)和一型菊糖果糖转移酶(DFA-I-f
6、orming inulin fructotrans-ferase，IFTase-，EC 4 2 2 17)分别酶解为三型双果 糖 酐 DFA-和 一 型 双 果 糖 酐 DFA-7 8。DFA-是一种功能性甜味剂，能量低，可以促进矿物质的吸收，降低胆固醇，抗龋齿，增殖有益菌9。DFA-可被 DFA-ase 进一步水解为菊二糖。菊糖这 2 条代谢途径都生成了菊二糖，其中菊糖、菊粉型低聚果糖和 DFA-都具有特殊的功能，菊二糖却没有相关研究报道。另外，对低聚果糖的研究，多是直接研究混合糖的作用，没有分离出单一的糖，不能确定是哪种成分起作用，或是多种糖起协同作用。这主要由于酶法制备的低聚果糖为多种成
7、分的混合体，其单一成分难以实现规模化合成以及纯化。基于低聚果糖的生理功效，菊二糖也被推测为一种具有特殊功能的糖。然而菊二糖的产量很低，这限制了菊二糖相关性质的研究。天然菊二糖存在于牛蒡等植物的根茎和香蕉等水果内10 11，但是量很少，且与其他糖分离困难。酶法生产菊二糖有较大潜力，蔗糖转化酶催化的蔗糖转糖基反应中，不仅生成了果糖和葡萄糖，同时还生成了菊二糖、1-蔗果三糖、6-蔗果三糖、新蔗果三糖，但是果糖和葡萄糖是主要产物12。菊粉酶和 DFA-ase 也能催化获得菊二糖。菊粉酶水解菊粉得到的低聚果糖，主要成分为菊三糖、菊四糖，而菊二糖相对较少3，13。DFA-ase 能食品与发酵工业FOOD
8、AND FEMENTATION INDUSTIES22023 Vol.49 No.5(Total 473)够水解 DFA-获得单一的菊二糖，无其他副产物产生，因此，DFA-ase 在合成菊二糖方面有望成为一种关键酶。1975 年，具有水解 DFA-功能的酶首次从 Arthrobacter ureafaciens 中被鉴定出来14。1997年，DFA-ase 在 Arthrobacter sp H65-7 中被分离纯化出，该酶在 pH 4 5，60 时转化 DFA-为菊二糖的活性最高，同时该酶具有可逆催化功能，即催化菊二糖转化为 DFA-15。SAITO 等16 实现了 DFA-ase 基因在大
9、肠杆菌(Escherichia coli)中的异源表达。YU 等17 从 Arthrobacter aurescens SK8 001 中获得了DFA-ase 编码基因，并将其在大肠杆菌中克隆和表达，开启了国内有关 DFA-ase 的研究。通过凝胶过滤和 SDS-PAGE 结果，得知该酶是一种同源三聚体，其单亚基相对分子质量和全相对分子质量分别为49 kDa 和 145 kDa，酶的活性中心位于亚基与亚基的裂缝之间，在 pH 5 5，55 时催化 DFA-的活性最高。郁书怀18 鉴定出了 Arthrobacter chlorophenolicusA6 中的 DFA-ase，该酶是首个被报道能同
10、时降解菊糖为 DFA-，并催化 DFA-水解为菊二糖的酶，即该酶具有连续催化性，其晶体结构也被首次解析出。关于 DFA-ase 的研究目前仍然较少，且活性都较低，因此，获得活性高、专一性强的 DFA-ase 对于菊二糖的研究至关重要。本研究对来源于 A chlorophenolicus A6 的 AcD-FA-ase 进行分子改造，以期得到酶活性提高的突变体。由于设计的突变体数量较多，一一纯化测定酶活性，将十分耗时繁琐。糖分析方法主要有色谱法、比色法和滴定法等19。色谱法准确，但是耗时，滴定法不适用于大批量样品的测定。比色法利用紫外-可见分光光度法和标准曲线进行定量分析，有苯酚-硫酸 法、蒽
11、酮-硫 酸 法 和 3，5-二 硝 基 水 杨 酸(3，5-dinitrosalicylic acid，DNS)法，前2 种方法利用浓硫酸将多糖水解为单糖并脱水生成糖醛，再和苯酚/蒽酮生成有色化合物，利用分光光度计测量19。DNS 法的原理是还原糖在碱性条件下与 DNS 反应生成红棕色化合物，且颜色深浅在一定范围内与还原糖的量成正比，准确性高，重复性好，被广泛使用20 21。菊二糖作为一种还原糖14，可利用 DNS 法检测。另外，高通量筛选技术可大大提高筛选效率22 23，所以本研究采用 96 孔板进行高通量培养，配合 DNS 法快速检测酶活性，筛选高酶活性的突变体，以期为DFA-ase 突变
12、体文库的快速筛选，菊二糖的大量生产、性质研究以及菊糖这一代谢途径的补充奠定基础。1材料与方法1 1材料1 1 1菌株与质粒大肠杆菌 Escherichia coli BL21(DE3)、Escherichi-a coli DH5，生工生物工程(上海)股份有限公司、含Arthrobacter chlorophenolicus A6 来源的 DFA-ase 基因的重组质粒 pET22b-AcDFA-ase 由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，保藏在本实验室。1 1 2工具酶PrimeSTA HS DNA Polymerase 高保真酶和Dpn 消化酶，TaKaa 公司。1 1 3培养基与主要试
13、剂配制LB 培养基(g/L):胰蛋白胨 10，酵母粉 5，NaCl10，调整 pH 至 7 0，固体培养基在此基础上加入20 g/L 琼脂粉，121 高压灭菌 20 min。液体培养基中加入氨苄青霉素至 50 g/mL，固体培养基中添加至100 g/mL。配好的液体培养基于室温存放，平板置于 4 冰箱存放。纯化所用缓冲液参考文献 18的配制方法。Binding buffer:500 mmol/L NaCl、50 mmol/L NaH2PO4和 50 mmol/L Na2HPO4，pH 7 4;Wash buffer:在 Bind-ing buffer 基础上添加50 mmol/L 的咪唑，用于
14、洗除杂蛋白;Elution buffer:在 Binding buffer 基础上添加200 mmol/L 咪唑，用于洗脱结合在柱子上的目的蛋白;酶透析液:Binding buffer 中不添加 NaCl 和咪唑但添加 10 mmol/L EDTA，用于去除蛋白溶液中的高浓度盐分和金属离子;酶透析液:在透析液 I 的基础上不添加 EDTA，目的是进一步去除溶液中的盐分、金属离子以及 EDTA。DNS 试剂:18 2 g 酒石酸钾钠溶解于50 mL 去离子水中，趁热加入 0 63 g DNS，2 1 g NaOH 和 0 5 g苯酚，搅拌至溶解，冷却后定容至100 mL，贮于棕色瓶中，室温保存，
15、放置 1 周后使用。1 1 4主要仪器ProFlex PC 仪，美国赛默飞公司;Nano-300 微量分光光度计，杭州奥盛公司;酶标仪，南京拜尔沃公司;电泳仪，美国 BIO-AD 公司;4600SF 凝胶成像仪，上海天能公司;GL-21MS 离心机，卢湘仪离心机仪器有限公司;台式摇床，上海知楚仪器公司;超声波细胞粉碎机-粗频变杆，南京非奇经贸。研究报告2023 年第49 卷第5 期(总第473 期)31 2实验方法1 2 1突变体的构建基于 AcDFA-ase 生物信息学分析、晶体结构，理性设计突变位点。基于 AcDFA-ase 基因序列设计含有突变氨基酸的 PC 引物，序列见表 1，其中C3
16、87A 是重复本课题组之前的工作18。表 1定点突变所用引物Table 1Primers for site-directed mutagenesis引物核苷酸序列(5-3)T310K-FCATGAACCGTGGAAGCCGTTTT310K-CCAAAAAACGGCTTCCACGGTTCA209C-FTCATAATTTTATTTGCGAATGTGGTTCTA209C-GAACCACATTCGCAAATAAAATTATGATGS82C-FTGGCTTTACCTGCTCAAGCATTCGS82C-GAATGCTTGAGCAGGTAAAGCCATGV89T-FTCGCTTTAATACTCCGGAAGAAGAATGGCV89T-TCTTCTTCCGGAGTATTAAAGCGAATGCT270A-FGGCGTCACCGCTTCTTCAGTTACCAAT270A-TTGGTAACTGAAGAAGCGGTCACGCCTE294A-FTTCTAGTGCTAATCTGGTTGCCACCAATCE294A-TGGTGGCAACCAGATTAGCACTAGAATT310A-FCATGAACCGTGGGCTCC