1、实验研究睡眠剥夺对小鼠大肠组织炎症反应和氧化应激的影响王鑫梅梁樱杨帅许可刘琪张津玮薄靳华DOI:1012089/jca202301014基金项目:国家自然科学基金(81600958，81701102);南京大学医学院附属鼓楼医院临床试验基金(2022-LCYJ-PY-37)作者单位:210008中国药科大学南京鼓楼医院药学部(王鑫梅);南京大学医学院附属鼓楼医院麻醉科(梁樱、杨帅、许可、刘琪、张津玮、薄靳华)通信作者:薄靳华，Email:bojinhua8888 126com【摘要】目的探讨睡眠剥夺对小鼠大肠组织炎症反应和氧化应激的影响。方法选择 SPF级雄性 C57 小鼠 32 只，812
2、周龄，体重 1822 g。采用随机数字表法分为四组:空白对照组(C 组)、切口组(I 组)、睡眠剥夺组(A 组)和睡眠剥夺+切口组(AI 组)，每组 8 只。C 组正常饲养，I 组建立切口模型，A 组使用睡眠剥夺箱睡眠剥夺 48 h，AI 组使用睡眠剥夺箱睡眠剥夺 48 h 后建立切口模型。取小鼠大肠组织，采用 Western blot 法检测白细胞介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子-(TNF-)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶 2(NOX2)和超氧化物歧化酶 2(SOD2)蛋白含量，超氧化物阴离子荧光探针法检测活性氧(OS)荧光强度，免疫荧光染色法检测 NOX2 荧光强度。结果与 C组
3、比较，I 组、A 组和 AI 组大肠组织 IL-1、TNF-和 NOX2 蛋白含量明显升高(P0.05)，SOD2 蛋白含量明显降低(P0.05)，OS 和 NOX2 荧光强度明显增强(P0.05)。与 I 组比较，A 组和 AI 组大肠组织 IL-1、TNF-和 NOX2 蛋白含量明显升高(P0.05)，AI 组大肠组织 SOD2 蛋白含量明显降低(P0.05)，OS 和 NOX2 荧光强度明显增强(P0.05)。与 A 组比较，AI 组大肠组织 IL-1、TNF-和 NOX2 蛋白含量明显升高(P0.05)，SOD2 蛋白含量明显降低(P0.05)，OS 和 NOX2 荧光强度明显增强(P
4、0.05)。结论睡眠剥夺会引起小鼠大肠组织炎症反应和氧化应激，睡眠剥夺下行切口手术会进一步加重炎症反应与氧化应激。【关键词】睡眠剥夺;炎症反应;氧化应激;活性氧;小鼠Effects of sleep deprivation on intestinal inflammatory response and oxidative stress in miceWANGXinmei，LIANG Ying，YANG Shuai，XU Ke，LIU Qi，ZHANG Jinwei，BO Jinhua Department of Phar-macy，China Pharmaceutical University
5、 Nanjing Drum Tower Hospital，Nanjing 210008，ChinaCorresponding author:BO Jinhua，Email:bojinhua8888 126com【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of sleep deprivation on intestinal oxidative stressand inflammatory response in mice MethodsThirty-two SPF male C57 mice，aged 812 weeks，weighing1822
6、g，were divided into four groups using random number table method:blank control group(groupC)，incision group(group I)，sleep deprivation group(group A)，and sleep deprivation+incision group(group AI)，eight mice in each group Group C were kept normally，group I were established into incisionmodel，group A
7、 were established into sleep deprivation model by depriving for 48 hours in a sleep depriva-tion chamber，and group AI were established into incision and sleep deprived models The expression of in-terleukin-1(IL-1)，tumor necrosis factor-(TNF-)，nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxi-dase 2(NO
8、X2)and superoxide dismutase 2(SOD2)protein were detected by Western blot The fluores-cence intensity of reactive oxygen species(OS)was detected bydihydroethidium and NOX2 fluorescenceintensity was detected by immunofluorescence esultsCompared with group C，the expression of IL-1，TNF-and NOX2 protein
9、were significantly increased(P 0.05)，the expression of SOD2 protein was sig-nificantly decreased(P 0.05)，and OS and NOX2 fluorescence intensity were significantly enhanced(P 0.05)in colonic tissues in groups I，A and AI Compared with group I，the expression of IL-1，TNF-and NOX2 protein of colonic tiss
10、ues in groups A and AI were significantly increased(P 0.05)，the expression of SOD2 protein in group AI was significantly decreased(P 0.05)，and the fluorescenceintensity of OS and NOX2 in group AI were significantly enhanced(P 0.05)Compared with group A，the expression of IL-1，TNF-and NOX2 protein wer
11、e significantly increased(P 0.05)，the expression27临床麻醉学杂志 2023 年 1 月第 39 卷第 1 期J Clin Anesthesiol，January 2023，Vol39，No1of SOD2 protein was significantly decreased(P 0.05)，and OS and NOX2 fluorescence intensity weresignificantly enhanced(P 0.05)in colonic tissues in group AI ConclusionSleep deprivat
12、ion can causeintestinal inflammatory response and oxidative stress in mice，and the inflammatory response and oxidativestress will be further aggravated by sleep deprivation and surgery【Key words】Sleep deprivation;Inflammatory response;Oxidative stress;eactive oxygen spec-ies;Mice术前睡眠剥夺在手术患者中尤为常见，约70
13、%以上的手术患者均存在一定程度的睡眠剥夺12。睡眠剥夺的发生原因包括术前或术后的焦虑状态、恶心、呕吐、疼痛等。睡眠剥夺会导致低度炎症反应和氧化应激，不利于患者术后恢复。OS 与睡眠剥夺密切相关，睡眠剥夺会导致肠道内的 OS 大量积累，从而导致机体产生氧化应激反应34。本实验研究拟通过构建不同模型小鼠，观察睡眠剥夺后小鼠大肠组织中炎性因子及氧化应激蛋白的表达变化，从分子水平探讨其在睡眠剥夺中的作用。材料与方法实验动物SPF 级雄性 C57 小鼠 32 只，812周龄，体重 1822 g，北京维通利华实验动物中心提供(SYXK 苏 20190059)。饲养条件:室温 18 22，12 h/12 h
14、 昼夜节律，自由饮食水。实验分组与处理采用随机数字表法分为四组:空白对照组(C 组)、切口组(I 组)、睡眠剥夺组(A 组)和睡眠剥夺+切口组(AI 组)。C 组正常饲养，I 组建立切口模型，A 组使用睡眠剥夺箱睡眠剥夺 48 h，AI 组使用睡眠剥夺箱睡眠剥夺 48 h 后建立切口模型。建立切口模型小鼠吸入 2%七氟醚麻醉后，三头肌肌注青霉素 30 000 IU 建立切口模型。后爪趾肌外使用 10%碘伏消毒，铺无菌洞单。11 号刀片在后爪趾肌位置切开皮肤和筋膜后，纵行切开一个1 cm 的切口，从离脚后跟 0.5 cm 处一直延伸到脚趾。轻压迫止血后，用 FS-2 针 50 尼龙丝线行褥式缝合
15、，切口用金霉素软膏覆盖5，产生切口即为建模成功。16 只小鼠均建模成功。建立睡眠剥夺模型参照文献 6描述的方法，使用睡眠剥夺箱(X-XS108 型)建立睡眠剥夺模型，将小鼠放入睡眠剥夺箱，箱内放置一根旋转杆，并保持恒定运动(7 圈/分，顺时针和逆时针交替旋转)进行睡眠剥夺，睡眠剥夺 48 h，期间小鼠自由饮食水。使用脑电睡眠电极进行监测，监测清醒时间、快速动眼睡眠时间、非快速动眼睡眠时间。非睡眠剥夺小鼠清醒时间占整体时间 50%，快速动眼睡眠时间占整体时间 42%，非快速动眼睡眠时间占整体时间 8%;睡眠剥夺小鼠清醒时间占整体时间73%，快速动眼睡眠时间占整体时间 25%，非快速动眼睡眠时间占
16、整体时间 2%，睡眠时间较非睡眠剥夺小鼠缩短，清醒时间延长，提示建模成功。16 只小鼠均建模成功。Western blot 法取大肠组织(回盲部)加入胰酶消化并提取总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度，煮沸 5min。上样 80 g 至 8%SDS-PAGE 进行电泳后，将蛋白质电转到 PVDF 膜。5%脱脂奶粉室温封闭 2h，加入一抗白细胞介素-1(interleukin-1，IL-1)(货号:ab254360，11 000)、肿瘤坏死因子-(tumornecrosis factor-，TNF-)(货 号:ab215188，1 1 000)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶 2(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidases2，NOX2)(货号:ab129068，11 000)、超氧化物歧化酶 2(superoxidedismutase 2，SOD2)(货 号:ab68155，11 000)和-actin 抗体(货号:ab6276，15 000)，4 孵育过夜，TBST 漂洗 3 次，每次 5 min，加入 HP 标记的山羊抗兔