1、DB32/T4565-2023埃及血吸虫核酸检测重组酶介导等温扩增法1范围本文件描述了检测人休尿液中埃及血吸虫核酸的重组酶介导核酸等温扩增法。本文件适用于各级疾病预防控制机构和医疗机构对埃及血吸虫核酸的检测注：埃及血吸虫的基本信息，流行病学及临床表现见附录A。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件：不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1重组酶介导核酸等温扩增技术recombinase-
2、aided amplification;RAA一种利用重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶在等温条件下（一般为39）进行核酸扩增的技术。注：其原理为重组酶与引物紧密结合扫描双链DNA,当搜索到与引物同源的序列时，使双链DNA解旋，单链结合蛋白防止单缝DNA复性.引物在DNA聚合酶作用下沿模板链延伸，合成新的DNA互补链，5min15mi就可实现用仪器检测只的凯标的扩增。4仪器与设备4.1RAA恒温核酸扩增检测仪带有恒温(391)扩增功能的荧光检测仪.荧光检测激发波长480nm,发射波长520nm4.2恒温振荡混匀仪带有恒温功能(39土1)，且能把固体、液体物质充分混匀。4.3离心机相对离心力15
3、00g4.4微量可调移液器量程为100L1000L、20L200L、2L20uL及0.5L10L。DB32/T4565-20235试剂与材料5.1试剂休液核酸提取试剂盒、RAA扩增反应体系及缓冲液（也可采用等效的商品试剂盒）、无水乙醇和水(符合GB/T6682的要求)。5.2材料离心管(50mL、1.5mL)及离心管架、PCR管(0.2mL)及管架、微量可调移液器配套吸头、一次性使用敷料摄、一次性医用手套和一次性医用口罩。5.3引物与探针扩增埃及血吸虫细胞色素C氧化酶相关基因(COX1)基因的特异性引物及探针，如表1所示。表1埃及血吸虫C0X1基因引物与探针引物/探针序列(5-3)正向引物CT
4、TGATTATATATGCTTAAAAGCTGTGGGTC反向引物TAAAGCTATACCAGTAACACCACCTATCGT探针CTGTGGGTCTCGTGTATGAGATCCTATAGTTTGATGATTGGTTGGTTTTA”探针序列的第31位碱基修饰荧光报告基团俊基荧光素(FAM)、第35位碱基修饰淬灭基团以及第33位碱基修饰四氢吹喃残基6样本前处理与核酸提取6.1样本样本为受试者尿液。6.2样本采集6.21登记受检者编号信息，将样本信总贴二洁冷尿液收集容器上。6.2.2采集受检者上午10点至下午2点之间的尿液，避免粪便污染，女性应避开生理期留取尿液样本。6.2.3肉眼观察尿液颜色与性
5、状（淡黄、带血或血尿等）并作永，摇动混匀后采集尿液5mL10mL,加盖密封保存。6.2.4采集后应及时送检，室温下保存时问不超过4h:不能及时送？的，应九4冷藏，保存时间不超过24h6.3核酸提取6.3.1将采集的尿液移入离心管中，1500g离心5min或静置15min。6.3.2倾倒或吸弃上清尿液，取200L尿沉渣样本，使用休液核酸提取试剂盒，按照操作说明提取核酸。6.3.3取2L制备好的核酸样本进行检测，或保存至一20备用。2DB32/T4565-20237核酸检测7.1向含有RAA反应休系的PCR管（见附录B)中加入45.5L缓冲液7.2在反应管的管盖中加入2.5L乙酸镁。73将2L阴性
6、质控品加入反应管中作为阴性对照，然后将2L待测样本依次加人不同反应管中，最后将2L阳性质控品加入反应管作为阳性对照，各反应管总体系为50L。7.4将反应管置于恒温振荡混匀仪中，在39下振荡混匀4min。7.5将反应管置于RAA恒温核酸扩增检测仪（也可采用其他等效的荧光检测仪）中进行实时检测，设置反应温度39，时间30min。8结果判定8.1阳性判定8.1.1反应结束后，设置斜率为20，仪器将进行数据分析，白动呈现判定结果。8.1.230mi内，扩增曲线的斜率20时判定为阳性：否则判定为阴性，见附录C。8.2质量控制8.2.1阳性质控品检测结果判定为阳性：阴性质控品检测结果判定为阴性。8.2.2如检测结果不符合8.2.1的要求，该试验视为无效，应检查仪器、试剂等的偏差，确认无误后重新检测。3