1、 收稿日期:2 0 2 2-0 8-0 9 修回日期:2 0 2 2-1 0-2 0基金项目:国家自然科学基金(2 2 1 7 4 1 3 0)*通讯作者:汪晶,男,博士,副教授,研究方向为床边即时诊断(P O C T)等.E-m a i l:j i n g w 1 9 8 6 z j u t.e d u.c n第3 9卷第3期V o l.3 9 N o.3分 析 科 学 学 报J OUR NA LO FANA L Y T I C A LS C I E N C E2 0 2 3年6月J u n e 2 0 2 3D O I:1 0.1 3 5 2 6/j.i s s n.1 0 0 6-6 1
2、 4 4.2 0 2 3.0 3.0 1 8侧流免疫层析技术在黄曲霉毒素B1检测中的研究进展童 璐,李大权,汪 晶*(浙江工业大学化学工程学院,浙江杭州3 1 0 0 1 4)摘 要:侧流免疫层析技术(l a t e r a l f l o wi mm u n o a s s a y,L F I A),是一种将色谱层析和免疫技术相结合的快速分析方法,为黄曲霉毒素B1(A F B1)的现场快速检测提供了一个良好平台。本文从比色和荧光两种方法介绍了侧流免疫层析技术在A F B1检测中的研究进展,重点阐述不同信号标记材料及其对应方法学,并讨论了目前免疫层析检测的不足及未来发展方向,以期为A F B1
3、的现场即时检测提供参考。关键词:侧流免疫层析技术;黄曲霉毒素B1;信号标记材料;生物受体;快速检测中图分类号:O 6 5 8.1 文献标识码:A 文章编号:1 0 0 6-6 1 4 4(2 0 2 3)0 3-3 6 7-0 5黄曲霉毒素是寄生曲霉和黄曲霉共同作用下产生的次级代谢产物,广泛存在于谷物、食品和饲料中,可能导致癌症、D NA突变和畸胎。黄曲霉毒素B1(A f l a t o x i nB1,A F B1)是黄曲霉毒素的一种,其分布最广、毒性最强、危害最大。因此,A F B1被国际癌症研究机构归类为I类致癌物1。世界上许多国家和地区制定了食品中A F B1的最高允许限量,欧盟一般为
4、52 0g/k g,美国一般为2 0g/k g,中国一般为0.52 0g/k g2。鉴于A F B1的低允许限量,亟需灵敏、简便的分析方法来评估食品和农产品中微量A F B1。目前,常用的A F B1检测手段有高效液相色谱3和液相色谱-质谱联用4等。虽然这些方法准确度高,但通常需要大型仪器和专业人员,操作繁琐且耗时。基于农场、海关和超市等资源有限地区快速、现场筛查的需要,免疫分析法已被广泛用于饲料与谷物中A F B1的检测。常见的A F B1的免疫检测方法有酶联免疫吸附试验5、电化学免疫分析和比色免疫分析6等。其中,侧流免疫分析技术(L F I A)以其简单、快速、用户友好等优势而得到广泛的认
5、可。本文简要概述了侧流免疫分析技术、A F B1的检测原理及进展,并对存在的不足及未来发展方向进行讨论。1 侧流免疫分析侧流免疫层析试纸主要由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜(N C膜)和吸收垫等4部分组成(图1 A)。在N C膜上有用于观察判断检测结果的检测线(T线)和用于判定检测结果是否有效的控制线(C线)7。根据免疫结合模式的不同,L F I A主要分为两种类型8(图1 B):(1)双抗夹心法。待测物与信号探针结合,在T线上被预固定抗体捕获,形成三明治夹心结构,其特点是待测物浓度与T线信号强度成正比。(2)竞争法。待测物在T线与预固定的包被抗原竞争结合信号探针,从而释放先前结合的信号探针,其
6、特点为待测物浓度与T线信号强度成反比。黄曲霉毒素B1是小分子物质9,通常适用于竞争法。以胶体金为标记材料,测定原理如图1 C所示。将A F B1-B S A和羊抗鼠I g G预先铺设在T线与C线上,当样品中没有A F B1时(阴性检测),A u N P s-A F B1a n t i b o d y可与T线上的A F B1-B S A相结合,在T线观察到红色条带;当样品中存在A F B1时(阳性检测),A u N P s-A F B1a n t i b o d y首先与样品中的A F B1进行结合,从而抑制了与T线上A F B1-B S A的结合,导致T线上观察不到明显红色条带。剩余信号探针继
7、续迁移至C线处,被固定的羊抗鼠I g G捕获,验证检测的763第3期童璐等:侧流免疫层析技术在黄曲霉毒素B1检测中的研究进展第3 9卷有效性。图1 侧流免疫层析试纸的结构7(A)、检测模型8(B)及A F B1检测原理图9(C)。F i g.1 S c h e m a t i cd i a g r a mo f s t r u c t u r e7(A),d e t e c t i o nm o d e l8(B),a n dA F B1s e n s i n gp r i n c i p l e9(C)o f l a t e r a l f l o wi mm u n o c h r o m
8、 a t o g r a p h y.2 比色法胶体金是氯金酸水溶液在还原剂作用下,聚合成特定大小的金纳米颗粒,尺寸为1 04 0n m1 0。当这些标记物在特定位置大量聚集时,肉眼可见红色或粉红色斑点,因而可用于定性或半定量测定。如图2 A所示,X i n g等人1 1利用金纳米颗粒和抗体制备了标记探针,设计开发了一个通道可调的多重侧向流动条云平台。将多种霉菌毒素-B S A和小鼠I g G喷洒在N C膜上形成多条T线和C线。阳性测定时,目标分析物首先会特异性地与A u N P s探针结合,形成偶联物。此时,偶联物不再被T线上的包被抗原所捕获,但与C线山羊抗小鼠I g G反应并捕获。在阴性测
9、定时,探针与T线抗原反应,形成A u N P s-抗体-毒素-B S A复合物,而多余探针将被捕获在C线上。结果表明,小麦中A F B1的可视化检测限和定量检出限分别为2 0g/k g和4g/k g。抗体与标签的结合效率与温度和p H等因素相关,从而影响检测性能1 2。因此,研究者提出了纳米材料标记核酸适配体的方法。核酸适配体可特异性识别单一小分子、复杂的混合物以及完整的有机体1 3。将核酸适配体应用于层析试纸条,可将小分子检测从传统竞争型转换成三明治模型,有效降低反视觉观察的不准确性1 4。Z h a n g1 5等构建了基于适配体功能化金纳米颗粒的侧流免疫层析试纸,其可视检测限为1 0n
10、g/m L,定量检测限为1.0 5n g/m L。传统胶体金标签仅依靠光吸收进行显色,灵敏度有限。基于此,研究人员致力于开发新型的酶标记材料,通过酶催化显色以提高可视化检测的灵敏度。当前,基于纳米酶的生物检测方法主要集中于使用类过氧化物酶纳米酶,这类酶能在特定情况下识别并诱导过氧化物酶底物催化1 6。通过酶显色催化反应,可进一步信号放大,实现高灵敏可视化定性识别。如图2 B所示,C a i1 7将M n O2纳米片作为抗体的标记物,利用了M n O2-TMB催化显色体系发展了一种检测A F B1的竞争型L F I A。首先探针与T线上的抗原结合形成棕色带,随后在T线上添加TMB溶液,利用M n
11、 O2-TMB催化放大系统增强T线上的信号颜色。该方法的检出限为1 5p g/m L,检测范围跨越4个数量级,可满足不同国家对食品和饲料中A F B1残留限量的要求。3 荧光法基于胶体金及酶显色的L F I A只能实现对A F B1的定性或半定量检测,灵敏度还有极大的提升空间。863第3期分 析 科 学 学 报第3 9卷图2 基于比色法的A F B1免疫层析试纸条。(A)胶体金1 1;(B)纳米酶1 7。F i g.2 L a t e r a l f l o wi mm u n o c h r o m a t o g r a p h yb a s e do nc o l o r i m e t
12、 r y.(A)G o l dn a n o p a r t i c l e s1 1;(B)N a n o z y m e1 7.荧光纳米材料(如时间分辨荧光微球、荧光染料、量子点和上转换纳米粒子)因高量子产率、强光稳定性、低光学背景等特点,已作为信号标签广泛用于L F I A的定量分析1 8。图3 基于荧光纳米材料的A F B1侧流免疫层析测定。(A)时间分辨荧光微球2 0;(B)荧光染料2 6;(C)量子点2 8;(D)上转换纳米粒子3 4。F i g.3 D e t e r m i n a t i o no fA F B1l a t e r a l f l o wi mm u n o
13、c h r o m a t o g r a p h yb a s e do nf l u o r e s c e n tn a n o m a t e r i a l s.(A)T i m e-r e s o l v e df l u o r e s c e n tm i c r o s p h e r e s2 0;(B)F l u o r e s c e n td y e s2 6;(C)Q u a n t u md o t s2 8;(D)U p c o n v e r s i o nn a n o p a r t i c l e s3 4.时间分辨荧光微球是将成千上万个镧系元素荧光分子
14、包裹于单个纳米级聚苯乙烯微球中,利用镧系元素的长荧光寿命,消除背景干扰,可实现更灵敏的定量分析1 9-2 1。T a n g2 2等将E u/T b()负载在羧基963第3期童璐等:侧流免疫层析技术在黄曲霉毒素B1检测中的研究进展第3 9卷聚苯乙烯纳米球中,制得E u/T b()纳米球标签,可将A F B1的检测限降低至0.0 5n g/m L。C h a n g2 3等建立了一种多重时间分辨免疫层析技术同时定量检测6种谷物中的A F B1的新方法,其最低检测限为0.0 4g/k g。W a n g2 4等开发了一种用于玉米中A F B1检测的时间分辨荧光免疫层析技术,定量检出限为0.1 6g
15、/k g。S u n2 5等开发了用于中草药中A F B1检测的时间分辨荧光免疫层析技术,其定量检测限可达0.6 0g/k g。荧光染料具有优异的发光特性,标记抗体后可制得荧光信号标签。Z h a o2 6等研制了一种用于检测A F B1的侧向流动适配体层析试纸。在A F B1阴性样本中,C y 5标记的适配体首先在T线与部分互补链的单链D NA结合,剩余的适配体与C线上的p o l yT结合,即A F B1浓度越高,在T线上捕获的游离C y 5标记的适配体就越少,T线的荧光强度越低。结果表明,该试纸可将A F B1的检出限降低至0.1 6n g/m L。量子点作为一类新兴的生物荧光标记材料,
16、具有宽吸收、窄发射、强稳定性、高荧光量子产率等特点2 7。G u o等2 8通过一锅超声乳化法制备了高发光的磁性荧光微珠(MF B s)。将所得MF B s用作L F I A的信号标签,可实现老抽酱油中的A F B1的痕量检测,酱油提取物和纯黑酱油中的检出限分别为3和5 1p g/m L。J i a2 9等建立了基于量子点纳米棒的荧光免疫层析试纸条,用于食用和药用莲子中A F B1的现场检测,检出限为1n g/m L。L i3 0等合成了核壳量子点,基于该信号标签的荧光试纸对A F B1的检出限为0.0 0 5n g/m L。S h a o3 1等开发了一种基于量子点纳米珠的多重L F I A用于同时定量检测A F B1和Z E N,检测限分别为1.6 5p g/m L和5 9.1 5p g/m L。W a n g3 2等建立了一种基于红色荧光微球的侧向流动免疫分析技术,用于酒糟中A F B1的定量检测,其检测限为3.4g/k g。上转换荧光纳米粒子是一种能在长波长光(通常为红外光)激发下发射出短波长光(通常为可见光)的材料。它能避免生物背景荧光的干扰、有机类发光标记物稳定性差以及量子