1、河南农业科学,2 0 2 3,52(7)：136-143Journal of Henan Agricultural Sciencesdoi:10.15933/ki.1004-3268.2023.07.0141株光合细菌的分离鉴定、培养基优化及脱氮特性研究靳鹏，和子涵，武婧玉，贾一然，张晓彤，张建新（河南师范大学水产学院，河南新乡4530 0 7)摘要：优化光合细菌发酵培养基，并研究其产酶特性和脱氮特性，以提升光合细菌在水质改良中的效果。采用双层平板法从河南省新乡市卫河水域底泥中分离筛选出1株光合细菌，命名为WH-1,通过菌株形态学观察及16 SrDNA序列分析，确定分离菌株WH-1为沼泽红假单
2、胞菌（Rhodopseudomonaspalustris)。为提高培养的WH-1菌液浓度,采用单因素和正交试验优化发酵培养基,得到最佳培养基配方：CH,CO0Na1.0g/L、NH 4Cl 0.5g/L、酵母浸粉3.0 g/L、Na CI2.0 g/L、K,H PO 40.2 g/L、Na H CO,3.0 g/L、MgS040.2g/L。培养基优化之后，经流式细胞仪计数，WH-1菌液浓度达到4.37 10 个/mL，较优化前增长43.33%。产酶特性试验结果显示，菌株WH-1可以产纤维素酶、淀粉酶，但不能产蛋白酶。在高质量浓度的氨氮（NH3-N）、亚硝酸氮（NO,-N)环境中，WH-1菌株的
3、NH,-N、NO,-N降解率分别达到49.8 9%和31.15%。综上，成功分离出1株性能优良的光合细菌WH-1，优化了培养基组成，该菌株展现出良好的产酶性能和脱氮能力。关键词：光合细菌；培养基优化；纤维素酶；淀粉酶；氨氮；亚硝酸氮中图分类号：S96Isolation and Identification of a Photosynthetic Bacterium Strain,Optimization of Culture Medium,and Study of DenitrificationJIN Peng,HE Zihan,WU Jingyu,JIA Yiran,ZHANG Xiaoto
4、ng,ZHANG Jianxin(College of Fisheries,Henan Normal University,Xinxiang 453007,China)Abstract:In order to enhance the effects of photosynthetic bacteria in water quality improvement,thefermentation medium of photosynthetic bacteria was optimized and the enzyme production anddenitrification characteri
5、stics were studied.A strain of photosynthetic bacterium named WH-1 was isolatedand screened from the sediment of Weihe River in Xinxiang City,Henan Province by the double-layer platemethod.Through morphological observation and 16S rDNA sequence analysis,the isolated strain WH-1 wasidentified as Rhod
6、opseudomonas palustris.To increase the concentration of WH-1 in liquid medium,singlefactor and orthogonal experiments were utilized to optimize the fermentation medium.The optimal mediumformula was obtained:CH,COONa 1.0 g/L,NH4Cl 0.5 g/L,yeast extract 3.0 g/L,NaCl 2.0 g/L,K,HPO40.2 g/L,NaHCO,3.0 g/L
7、,MgSO4 0.2 g/L.After the optimization of the medium,the concentration ofWH-1 reached 4.37x10 cells/mL,which increased by 43.33%compared with that before optimization.The results of the enzyme production characteristic test showed that the strain WH-1 could produce文献标志码：ACharacteristics文章编号：10 0 4-32
8、 6 8（2 0 2 3)0 7-0 136-0 8收稿日期：2 0 2 3-0 4-0 6基金项目：国家自然科学基金项目（3190 2 36 1）；河南省重点科技攻关项目（2 2 2 10 2 110 143,2 12 10 2 110 10 6）作者简介：靳鹏（1995-），男，山西长治人，在读硕士研究生，研究方向：水产微生物。E-mail:Micheal-J通信作者：张建新（197 4-），男，山东德州人，副教授，博士，主要从事水产微生物研究工作。E-mail:第7 期cellulase and amylase,but could not produce protease.In the
9、environment with high concentration ofammonia nitrogen(NH,-N)and nitrite nitrogen(NO,-N),the degradation rates of NH,-N and NO,-N ofWH-1 strain reached 49.89%and 31.15%,respectively.In conclusion,a strain of photosyntheticbacterium WH-1 with excellent performance is successfully isolated,and the com
10、position of the medium isoptimized.WH-1 shows good enzyme production and denitrification ability.Key words:Photosynthetic bacterium;Medium optimization;Cellulase;Amylase;NH,-N;NO,-N工厂化水产养殖是我国水产养殖发展的一个趋势。改革开放以来，中国的水产养殖业发展迅猛，养殖产量已连续30 a位列世界第一2 。为了提高产量，水产动物大多采用高密度的养殖模式3，而这也导致水环境污染方面的问题越来越严重(4-5。水环境中的氨氮
11、（NH3-N)随饵料进入水生生物体后，会影响生物体内的酶水解作用及膜的稳定性，引起水生生物呼吸不畅、抗病能力下降等诸多问题6 ;亚硝酸氮（NO,-N)也会对水生生物产生一定的毒性及致癌作用，影响水生生物正常的生长发育。因此，在水产养殖业中，如何能富有成效地调节水质环境是一个十分严峻的问题7。在调节水质方面，微生物处理法因其操作简单、维护成本低和污染物去除效率高而受到广泛关注8-10 。光合细菌（PSB)作为常见的水质改良剂I,其分布非常广泛，一般在江海、湖泊、沼泽地、水塘和泥土中都有生长2-13,具有无毒、无害、无残留等特点4。光合细菌不仅可以有效降低水体中NH,-N、NO,-N等有害物质，还
12、能调节水质环境15-16,在生物环境修复、生物能源生产和农业等领域有着广泛的应用17 。此外，光合细菌本身又是一种富含大量营养物质、价值较高的微生物，可被用作养殖鱼类的食物13。光合细菌应用于水产养殖废水处理，有利于提升水质改良效果18-19、鱼的免疫力和存活率、水产养殖业的生产效益，在水产养殖系统中的废物清除中发挥着重要作用2 0 。目前，市场上售卖的光合细菌良莠不齐，菌液浓度不高，影响了光合细菌在水产养殖业的使用，主要原因是菌种纯度不高，产品质量不稳定。鉴于此，有必要对光合细菌发酵培养基进行优化，提升光合细菌菌液浓度，促进光合细菌对水产养殖水环境的改良和养殖鱼体的健康生长。试验以分离出的光
13、合细菌为对象，优化光合细菌发酵培养基配方，并探究其产酶特性以及降NH,-N、NO,-N能力，旨在为光合细菌大规模工业化生产及在水产养殖应用提供理论依据。靳鹏等：1株光合细菌的分离鉴定、培养基优化及脱氮特性研究NaHCO,1.0g/L,调pH值为7.0。分离培养基:CH,COONa 3.0 g/L、CH,CH,CO O Na0.3 g/L、Na Cl 1.0 g/L、M g SO 4 0.2 g/L、(NH,),SO 4 0.3 g/L、KH,PO4 0.5 g/L、K,H PO 4 0.3 g/L、Ca Cl,50 mg/L、酵母浸粉1.0 g/L、谷氨酸0.2 mg/L、M n SO 42.
14、5mg/L、蛋白陈10 mg/L、Fe S0 45mg/L、琼脂18 g/L,调pH值为7.0。发酵方培养基：将密集培养基中乙醇去除。羧甲基纤维素钠培养基：KH,PO41.5g/L、蛋白陈5.0 g/L、酵母膏0.5g/L、M g S0 40.2 g/L、Na Cl 5.0 g/L、琼脂8.0 g/L、羧甲基纤维素钠10.0 g/L，调pH值为7.2。淀粉培养基：可溶性淀粉2.0 g/L、蛋白陈10.0g/L、牛肉膏5.0 g/L、Na Cl 5.0 g/L、琼脂15.0 g/L,调pH值为7.0。1371材料和方法1.1试验材料1.1.11主要试剂提DNA试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司
15、；Taq酶购自郑州久是生物技术有限公司；通用引物购自深圳华大基因科技有限公司；NaOH、NH,CI、Na NO,购自天津市德恩化学试剂有限公司;Hgl,、Ci o H,NH CH,NH 2HCI购自上海阿拉丁有限公司；KI购自天津市津北精细化工有限公司；KNaC,H.ONH,SO,C.H,NH,购自天津市大茂化学试剂厂羧甲基纤维素钠购自天津市恒兴化学试剂有限公司；刚果红、碘购自天津市科密欧化学试剂有限公司。1.1.2主要仪器双人单面净化工作台（郑州金友宁仪器有限公司，SW-CJ-2FD）、紫外可见分光光度计（岛津仪器苏州有限公司，UV-2600）、蒸汽灭菌器（KAGOSHIMASEISAKUS
16、YO,KG-SK-700）、光照培养箱（上海一恒有限公司，MGC-P）p H 计（奥豪斯仪器苏州有限公司，ST300）、白炽灯（6 0 W）、聚乙烯塑料瓶若干（6 0 0 mL、30 0 m L规格）。1.1.3培养基富集培养基：CH,CO0Na3.0g/L、NH,Cl1.0g/L、酵母浸粉1.0 g/L、乙醇1.5mL/L、NaCl 2.0 g/L、K,H PO 4 0.2 g/L、M g S0 4 0.2 g/L、138酪素培养基：酪素8.0 g/L、牛肉膏3.0 g/L、琼脂15.0g/L,调pH值为7.0。1.2光合细菌分离1.2.1取样与富集从河南省新乡市卫河水域中采集底泥，将样本放入烧杯中，密封带回水产工程技术研发中心实验室。将50 g样品加入到30 0 mL的带塞聚乙烯塑料瓶中，之后加满灭菌的富集培养基，将聚乙烯塑料瓶置于30、2 0 0 0 1x的光照培养箱中培养15d,直至聚乙烯塑料瓶中的液体变为红棕色时，吸取50 mL的富集液，再次富集培养。1.2.2分离和纯化采用双层平板法，取10 0 L富集培养液涂布于固体分离培养基上，之后再覆盖一层琼脂培养基，在30 下，进行