1、第5 2卷第4期第4 9 6页2 0 2 3年8月 华中科技大学学报(医学版)A c t aM e dU n i vS c iT e c h n o lH u a z h o n g V o l.5 2 N o.4 P.4 9 6A u g.2 0 2 3*青海省科技计划项目(N o.2 0 2 1-Z J-7 6 4)王烈宏,男,1 9 7 2年生,主任医师,E-m a i l:d o c t o r w l h 1 2 6.c o ml n c R NA H 1 9靶向m i R-4 7 3 5-3 p激活N F-B信号通路调控宫颈癌顺铂耐药*王烈宏,祁青玲,王乾印,高文君,王爱敏,曾 慧
2、青海红十字医院妇科,西宁 8 1 0 0 9 9摘要:目的 揭示l n c R NA H 1 9调控宫颈癌细胞顺铂(D D P)耐药的作用及分子机制。方法 体外建立顺铂耐药的宫颈癌细胞株H e L a/D D P。q R T-P C R检测H 1 9和m i R-4 7 3 5-3 p的表达。C C K-8实验检测不同浓度D D P作用下细胞的增殖抑制率,计算I C5 0值。克隆形成实验评估细胞增殖能力。流式细胞术检测细胞凋亡率。W e s t e r nb l o t实验检测凋亡相关蛋白B c l-2、B a x和c-C a s p a s e 3(c-C a s p 3)及N F-B信号通
3、路蛋白(p-I B/I B 和p-p 6 5/p 6 5)的表达。双荧光素酶报告基因实验和R NA交互沉降实验验证H 1 9和m i R-4 7 3 5-3 p之间的靶向关系。结果 H 1 9在H e L a/D D P细胞中高表达。敲低H 1 9增强H e L a/D D P对顺铂的敏感性,促进细胞凋亡。H 1 9能够与m i R-4 7 3 5-3 p靶向结合,敲低H 1 9上调H e L a/D D P细胞中m i R-4 7 3 5-3 p的表达。过表达m i R-4 7 3 5-3 p增强H e L a/D D P对顺铂的敏感性,促进细胞凋亡。抑制m i R-4 7 3 5-3 p能
4、够逆转H 1 9敲低对H e L a/D D P顺铂敏感性的增强作用。敲低H 1 9通过靶向m i R-4 7 3 5-3 p抑制p-I B 和p-p 6 5蛋白表达。结论 H 1 9通过靶向m i R-4 7 3 5-3 p,抑制N F-B通路活性,增强H e L a/D D P细胞的顺铂敏感性。关键词:宫颈癌;顺铂;l n c R NA H 1 9;m i R-4 7 3 5-3 p;N F-B信号通路中图分类号:R 7 3 7.3 3 D O I:1 0.3 8 7 0/j.i s s n.1 6 7 2-0 7 4 1.2 0 2 3.0 4.0 1 0l n c R N AH 1 9
5、A c t i v a t e sN F-BS i g n a l i n gP a t h w a yb yT a r g e t i n gm i R-4 7 3 5-3 pt oR e g u l a t eC i s p l a t i nR e s i s t a n c e i nC e r v i c a lC a n c e rW a n gL i e h o n g,Q iQ i n g l i n g,W a n gQ i a n y i ne t a lD e p a r t m e n t o fG y n e c o l o g y,Q i n g h a iR e
6、dC r o s sH o s p i t a l,X i n i n g8 1 0 0 9 9,C h i n aA b s t r a c t O b j e c t i v e T or e v e a l t h er o l ea n dm o l e c u l a rm e c h a n i s mo f l n c R NA H 1 9 i nr e g u l a t i n gc i s p l a t i nr e s i s t a n c e i nc e r-v i c a l c a n c e r c e l l s.M e t h o d s C i s p
7、 l a t i n-r e s i s t a n t c e r v i c a l c a n c e r c e l l l i n eH e L a/D D Pc e l l sw e r e e s t a b l i s h e di n v i t r o.T h e i n h i b i t i o nr a t eo f c e l l p r o l i f e r a t i o nu n d e r d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n so fD D Pw a sd e t e c t e db yC C K-8,
8、a n d I C5 0v a l u ew a s c a l c u l a t e d.C e l l p r o l i f-e r a t i v ec a p a c i t yw a sa s s e s s e db yc o l o n y f o r m a t i o na s s a y.C e l l a p o p t o s i s r a t ew a sd e t e c t e db y f l o wc y t o m e t r y.W e s t e r nb l o t a s s a yw a su s e dt od e t e c tt h e
9、e x p r e s s i o n so fa p o p t o s i s-r e l a t e dp r o t e i n sB-c e l l l y m p h o m a-2(B c l-2),B c l-2r e l a t e dXp r o t e i n(B a x),c-C a s p a s e 3(c-C a s p 3),a n dN F-Bs i g n a l i n gp a t h w a yp r o t e i n s(p-I B/I B a n dp-p 6 5/p 6 5).R e s u l t s l n c R NAH 1 9w a s
10、h i g h l ye x-p r e s s e d i n H e L a/D D Pc e l l s.K n o c k d o w no fH 1 9e n h a n c e dt h es e n s i t i v i t yo fH e L a/D D Pt oc i s p l a t i na n dp r o m o t e da p o p t o-s i s.H 1 9 c o u l d t a r g e t m i R-4 7 3 5-3 p,k n o c k d o w n o f H 1 9 u p r e g u l a t e d t h e e
11、x p r e s s i o n o f m i R-4 7 3 5-3 p i n H e L a/D D Pc e l l s.O v e r e x p r e s s i o no fm i R-4 7 3 5-3 pe n h a n c e dt h es e n s i t i v i t yo fH e L a/D D Pt oc i s p l a t i na n dp r o m o t e da p o p t o s i s.I n h i b i t i o no fm i R-4 7 3 5-3 pr e v e r s e dt h ep r o m o t
12、i n ge f f e c t so fH 1 9k n o c k d o w no nH e L a/D D Pc i s p l a t i ns e n s i t i v i t y.K n o c k d o w no fH 1 9 i n h i b i-t e dp-I B a n dp-p 6 5p r o t e i ne x p r e s s i o nb yt a r g e t i n gm i R-4 7 3 5-3 p.C o n c l u s i o n H 1 9e n h a n c e dc i s p l a t i ns e n s i t i
13、v i t yi n H e L a/D D Pc e l l sb yt a r g e t i n gm i R-4 7 3 5-3 pa n d i n h i b i t i n gN F-Bp a t h w a ya c t i v i t y.K e yw o r d s c e r v i c a l c a n c e r;c i s p l a t i n;l n c R NA H 1 9;m i R-4 7 3 5-5 p;N F-Bs i g n a l i n gp a t h w a y 宫颈癌是全球女性癌症相关死亡的主要原因之一,尤其在发展中国家,宫颈癌的健康负担
14、较为严重1。目前,宫颈癌的治疗主要有手术、化疗、放疗等综合性治疗手段,其中化疗是晚期或复发转移患者的常用治疗方法,但由于化疗耐药,往往导致化疗效果不佳2-3。因此,本研究拟从细胞水平探索宫颈癌的耐药机制,旨在为宫颈癌化疗耐药提供新思路。长链非编码R N A(l o n gn o n-c o d i n gR N A s,l n c R-N A s)是一类长度超过2 0 0n t的无蛋白编码能力的R N A分子4。多项证据已经阐明了l n c R N A s在肿瘤发生、进展和放化疗耐药中发挥重要调控作用5-6。l n c R N A A D AMT S 9-A S 2通 过m i R-2 2 3
15、-3 p/N L R P 3轴调控胃癌的进 展和顺铂(D D P)耐药7;l n c R N AT L R 8-A S 1通过增强T L R 8m R N A的稳定性来促进卵巢癌的转移和化疗耐药8;l n c R N A M S T 1 P 2通过影响S I R T 1/p 5 3信号通路影响膀胱癌对顺铂治疗的耐药9。也有研究报道,l n c R N A H 1 9可能参与了肿瘤化疗耐药过程,如C a i等1 0发现,l n c R N A H 1 9是乳腺癌紫杉醇耐药的调控因子;T i a n等1 1报道,l n-c R N AH 1 9通过m i R-2 9 b-3 p/S T AT 3通
16、路调控上皮性卵巢癌对顺铂的耐药。但目前关于H 1 9与宫颈癌化疗耐药的关系尚不明确。因此,本研究拟从细胞水平初步探索H 1 9对宫颈癌顺铂耐药的调控作用,并揭示调控潜在的分子机制,为解决转移性和复发性宫颈癌的化疗耐药问题提供参考。1 材料与方法1.1 顺铂耐药宫颈癌细胞(H e L a/D D P)培养H e L a细胞在含胎牛血清和双抗的R I P A 1 6 4 0完全培养液 中培养,培养 箱 条 件 设 置5%C O2和3 7。H e L a细胞经传代后,取生长密度在7 0%的细胞,使用含不同浓度顺铂(0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1g/m L)的培养液进行耐药培养,约34d递增一个浓度,直至细胞稳定在含1g/m LD D P的培养液中,进行传代培养。1.2 细胞转染靶向H 1 9的s i R NA序列(s i-H 1 9)及无意 义s i R NA对照(s i-N C)、m i R-4 7 3 5-3 pm i m i c s及对照m i m i c sN C、m i R-4 7 3 5-3 p i n h i b i t o r及对照i n h i b i t o