1、复旦学报（医学版）Fudan Univ J Med Sci2023 May，50（3）m6A-SAC-seq在单核苷酸分辨率水平检测RNA m6A修饰孟瀚哲1，2 何维志2 胡璐璐1，2（1复旦大学生物医学研究院 上海 200032；2复旦大学肿瘤研究所 上海 200032）【摘要】目的建立 m6A 特异性烯丙基标记测序（m6A-selective allyl chemical labeling and sequencing，m6A-SAC-seq）实验方法体系，在单核苷酸分辨率水平对 RNA 的 N6-甲基腺苷（m6A）修饰进行检测。方法m6A 烯丙基标记测序（m6A-SAC-seq）使用特
2、异性甲基转移酶 MjDim1对 m6A 添加烯丙基标记成为 N6-烯丙基-甲基腺苷（am6A），使用 I2处理产生 N1，N6-环化腺苷（A）产物，在逆转录时引入突变，从而实现在单核苷酸分辨率水平的检测。通过HPLC 法纯化甲基转移酶 MjDim1，使用探针及液相色谱-质谱联用系统（LC-MS/MS）检测 m6A 的转换率，计算MjDim1活性作为质控。提取样品 RNA，用烯丙基标记 m6A，并用 m6A-SAC-seq技术构建文库，测序后通过数据分析得到 m6A 位点信息，通过标准曲线校准计算得到 m6A 的含量。结果m6A-SAC-seq处理后，HIV 逆转录酶识别环化的 am6A 位点，
3、引入突变，但附近未修饰位点不发生突变。通过特定的 A 突变成 T/C的突变位置（A to T/C）来识别 m6A 位点，并添加内参探针，用标准曲线来定量 m6A 含量。结论m6A-SAC-seq 技术仅需 30 ng 的 mRNA 或去除了 rRNA的总 RNA样本就可以实现 m6A位点在单核苷酸分辨率水平的检测。【关键词】RNA甲基化；m6A甲基化；单核苷酸分辨率；m6A-SAC-seq；测序方法【中图分类号】Q3-3 【文献标志码】A doi：10.3969/j.issn.1672-8467.2023.03.017m6A-SAC-seq method detecting RNA m6A m
4、odification at single nucleotide resolution levelMENG Han-zhe1，2，HE Wei-zhi2，HU Lu-lu1，2（1Institutes of Biomedical Sciences，Fudan University，Shanghai 200032，China.；2Fudan University Shanghai Cancer Institute，Shanghai 200032，China）【Abstract】Objective To establish a step-by-step protocol of m6A-select
5、ive allyl chemical labeling and sequencing（m6A-SAC-seq）for detection of N6-methyladenosine（m6A）modifications of RNA at single nucleotide resolution level.Methods m6A-SAC-seq used specific methyltransferase MjDim1 to add allyl group to m6A，generating am6A.Then I2 was added to produce N1，N6-cyclized a
6、denine（A）products.Mutations were introduced during reverse transcription to achieve single-nucleotide resolution detection.Methyltransferase MjDim1 was purified by HPLC.The conversion rate of m6A was calculated by probe and liquid chromatography-mass spectrometry（LC-MS/MS）to determine the activity o
7、f MjDim1 as quality control.Sample RNA was extracted and m6A sites were labeled with allyl group.The DNA library was constructed with m6A-sac-seq technology and sent for high-throughput sequencing.After sequencing，m6A sites were inferred via data analysis.The stoichiometry of m6A was calculated by s
8、tandard curve calibration.Results After m6A-SAC-seq treatment，HIV reverse transcriptase recognized the cyclized am6A sites and introduced mutations during reverse transcription while the unmodified sites nearby remain unmutated.m6A sites could be identified by the specific mutation of A to T/国家重点研发计
9、划（2021YFA1100400）Corresponding author E-mail： 网络首发时间：2023-05-09 14 46 50 网络首发地址：https：/ 5月，50（3）C.Stoichiometry of m6A could be quantified by addition of spike-in probes and calibrating the mutation rate with the standard curve.Conclusion By using m6A-SAC-seq method，only 30 ng of mRNA or rRNA deplet
10、ed total RNA samples and is capable to detect RNA m6A sites at single-nucleotide resolution.【Key words】RNA methylation；m6A methylation；single nucleotide resolution；m6A-SAC-seq；sequencing methods*This work was supported by the National Key R&D Program of China(2021YFA1100400).RNA修饰在基因表达调控中扮演重要角色，哺乳动物
11、中最丰富的 mRNA内部修饰是 m6A修饰。m6A修饰参与RNA的转录、加工、剪切、翻译和降解过程1-4，研究显示m6A RNA甲基化与多种癌症的发生发展以及人类多种复杂疾病密切相关5-7。在近年的研究中，最常用的鉴定 m6A 甲基化方法 是 m6A 免 疫 沉 淀 测 序（methylated RNA immunoprecipitation sequencing，MeRIP-Seq）和 免疫沉淀定位法（m6A individual-nucleotide-resolution cross-linking and immunoprecipitation，miCLIP）8-9。然而，这些基于抗体的
12、方法有一些显著的局限性，包括重复性不高10、分辨率较低、需要大量样本以及在不同条件下比较 m6A 甲基化的能力有限，无法精确检测 m6A甲基化的变化。为了在单核苷酸分辨率上检测和量化转录组中m6A的水平，本文根据参考文献11进行改进，建立了m6A特 异 性 烯 丙 基 化 学 标 记 测 序（m6A-selective allyl chemical labeling and sequencing，m6A-SAC-seq）体系，并且保持较好的稳定性和重复性。该方法使用甲基转移酶MjDim1，替换常规的辅酶S-（5-腺苷）-L-同型半胱氨酸（S-（5-Adenosyl）-L-homocystein
13、e，SAM）为烯 丙 基-S-（5-腺 苷）-L-同 型 半 胱 氨（allyl-S-（5-Adenosyl）-L-homocysteine，Allyl-SAM），从而将RNA m6A加上烯丙基，成为am6A，通过I2处理将am6A进行环化，成为N1，N6环化A衍生物，HIV逆转录酶识别该环化产物并在逆转录时引入突变，构建文库，进行高通量测序后通过数据分析来鉴定 m6A位点。材 料 和 方 法合成 Allyl-SAM 向 100 mg SAM 中加入 1 mL乙酸、1 mL 甲酸、52.0 mg 高氯酸银和 2.125 mL 烯丙基溴，20 搅拌 8 h。加入 20 mL 0.1%三氟乙酸，使
14、反应淬灭。转移水相，用乙醚洗涤，使用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）（型号：176803000，美国 Waters公司）纯化 Allyl-SAM，-80 保存。m6A RNA 探针混合液的制备 设计和合成修饰含有 m6A 修饰的内参 RNA 探针。该内参探针由上 海 捷 瑞 生 物 工 程 有 限 公 司 合 成，序 列 中 含 有NNm6ANN（N 为 A，U，C 和 G 的混合物）的核心基序，以及特定的 8个核苷酸序列构成的“条形码”，分别代表 m6A 含量为 0、25%、50%、75%和 100%。由含有 m6A 修饰的 RNA 探针和相同序列的未修饰的RNA探针按照特定比例混合而成
15、（附件：表 1）。甲基转移酶 MjDim1 的制备 合成 MjDim1 并将其克隆到 pET-His-SUMO 质粒载体中，转化到T7 感受态细胞（编号：C2566I，美国 New England BioLabs 公司）中，活化菌种过夜，将活化的菌种接种到灭菌的 2YT培养基中，37 C培养 4 h，降温到16，继续培养 2 h，加入终浓度为 0.1 mmol/L 的IPTG 诱导表达，16 培养 1618 h。收集细胞，在裂解缓冲液（1PBS+150 mmol/L NaCl）中，用高压细菌破碎仪裂解细胞。使用镍柱亲和纯化后加Ulp1 酶，4 C 过夜，以去除 SUMO 标签。用洗脱缓冲 液
16、含20 mmol/L Tris-HCl（pH=7.5）、150 mmol/L NaCl和 20 mmol/L 咪唑 洗脱 MjDim1酶。使用 AKTA 蛋白纯化仪，经阴离子交换色谱（型号：Source15-Q，美国 General Electri 公司）和阳离 子 交 换 色 谱（型 号：Source15-S，美 国 General Electric公司）纯化，将蛋白梯度洗脱，采集蛋白峰并浓缩至 1.22.0 mmol/L，加入终浓度为 30%的甘油，于80 分装保存。MjDim1 活性测试 将 3 L 20 mmol/L Allyl-SAM，0.6 L 1 mol/L Tris HCl（pH=8.3）和 3 L 纯水混匀，配置成中和Allyl-SAM。用1结合/清洗缓冲液 含 10 mmol/L Tris-HCl（pH=7.5）、1 mmol/L EDTA 和 2 mol/L NaCl，清 洗 并 重 悬 磁 珠（Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beads）（美 国Thermo Fisher Scientific 公司），混匀后对照组和实验组每管分装