1、论著：引用格式：张佳，沈艳 信号通路在血管外膜 干细胞参与血管新内膜形成中的作用感染、炎症、修复，（）：信号通路在血管外膜 干细胞参与血管新内膜形成中的作用张 佳 沈 艳（昆明医科大学第一临床医学院，云南 昆明）【摘要】目的：探讨 信号通路在血管壁干细胞（）参与血管损伤后新内膜形成中的作用。方法：从 只健康 大鼠中随机选取 只制备颈动脉内皮损伤动物模型，分别于、时随机取 只大鼠，各取损伤部位的左颈总动脉 左右，制备血管组织冰冻切片，观察动脉内膜厚度的变化；行组织免疫荧光染色，计算、及 阳性细胞占 细胞的比例，观察损伤后 信号通路在 中的激活情况。另取 只大鼠随机分为假手术组、赋形剂组和抑制剂组
2、 组，每组 只。假手术组只分离血管，赋形剂组和抑制剂组均制备颈动脉内皮损伤模型，然后通过血管外膜分别给予磷酸盐缓冲液（赋形剂组）和 通路阻断剂（抑制剂组），测定各组损伤血管组织新内膜面积、中膜面积及其比值。余 只大鼠随机分为对照组和小干扰（）组，每组 只，均取颈总动脉外膜，通过免疫磁珠分选法筛选并纯化，组的 体外培养后转染 ；两组 均应用定量聚合酶链反应及 方法检测 基因及其蛋白表达水平。结果：血管新内膜随损伤后时间的延长而逐渐增厚。在损伤修复早期（损伤后 ），、表达比例明显升高，的表达比例未见明显升高；在损伤修复晚期（损伤后 ）后，细胞中的 表达量明显升高，、表达量下降。在血管内皮损伤术后，
3、通过外膜给药阻断 通路，新生血管内膜面积和内膜 中膜面积比均较赋形剂组下降。体外分离纯化后的模型大鼠 经转染 后，基因和蛋白表达下调，基因和蛋白表达水平上调。结论：信号通路在血管外膜 干细胞参与血管损伤后新生内膜的形成中发挥着重要作用。【关键词】血管内膜；再狭窄；血管壁干细胞；中图分类号：文献标识码：，：），），），基金项目：昆明医科大学大学生创新性实验项目（）通信作者：沈艳，讲师（：）感染、炎症、修复 年 月第 卷 第 期 （）：（），（），：；血管重塑性疾病发病早期的共同病理特征是形成血管新内膜。作为血管重塑性疾病，血管成形术以及冠状动脉（冠脉）搭桥术后发生的血管再狭窄严重限制了这类手术的
4、应用。血管平滑肌细胞是血管损伤后形成新内膜的主要细胞成分。目前临床上常用的药物洗脱支架便是通过支架在血管管腔内给药，以抑制新生内膜血管平滑肌细胞的增生，从而起到抗血管再狭窄的效果。这种方法虽然能够在一定程度上延缓血管内膜增厚，但同时又造成了支架边缘收缩性重塑，并导致损伤内皮修复的延迟，甚至诱发患者支架血栓的形成以及猝死。因此，针对该类疾病寻找到更加安全、有效的新型抗再狭窄的治疗方法显得尤为重要。近年来研究发现，血管壁干细胞（）存在于血管壁中，在血管重塑性疾病的发生或发展中均发挥了极重要的作用。在血管急性损伤出血后，各种致病原因可以导致 迅速从局部血管外膜组织向内膜部位迁移，促进病变所在区域新生
5、内膜上皮的迅速形成。然而目前针对 的研究仍较少，其参与血管病理性重塑的机制也有待进一步研究。本研究中以血管外膜中的 为研究对象，通过建立大鼠一侧颈动脉内皮剥脱动物模型，模拟人类冠脉介入治疗后再狭窄，研究磷酸酶和张力蛋白同源物（）磷脂酰肌醇 激酶（）蛋白激酶（）信号通路在 参与血管病理性重塑过程中的作用，旨在为动脉粥样硬化及再狭窄等心血管疾病防治的药物研发提供新型候选靶点。材料与方法 实验材料 动物：成年（）大鼠，体重 ，由中国昆明医科大学实验动物中心提供，实验所用动物使用许可证文号：（滇）。大鼠于干燥、通风良好的环境中饲养，每日光照 ，环境温度 ，空气湿度，大鼠自由摄食、饮水。药品与试剂：山羊
6、抗鼠 抗体（，），兔抗鼠 抗体（）、兔抗鼠 抗体（，细胞信号技术公司，美国），兔抗鼠 抗体（）、兔抗鼠磷酸化（）抗体（）、兔抗鼠 抗体（，英国），辣根过氧化物酶（）标记的羊抗兔 二抗（武汉博士德生物工程有限公司），异硫氰酸荧光素（）标记的驴抗山羊荧光二抗（，美国），标记的驴抗兔荧光二抗（，美国），信号通路阻断剂（细胞信号技术公司，美国），猴抗羊 磁珠试剂盒（，德国），小干扰 （，美国）。主要仪器：正置荧光显微镜（，奥林巴斯，日本），共轨聚焦荧光显微镜（，莱卡，德国），实时荧光定量 仪显微镜（）、垂直毛细管电泳仪器系列（，美国），半干转膜仪系统、凝胶成像仪系列（，美国）。实验方法 大鼠颈动脉内皮
7、损伤模型的建立用质量分数为 的盐酸戊巴比妥钠（）浸润麻醉大鼠脑后区域，暴露左侧颈总动脉及左颈内、外动脉，在左颈外动脉近心端用眼科剪做一“”形切口，向动脉近心端插入一根头端焊接在铜珠上的 ，长不锈钢钢丝，通过左颈外动脉引入到左颈总动脉，沿颈总动脉走行方向来回抽拉 次。假手术组只分离血管，不做其他处理。动物分组与处理从 只健康 大鼠中随机选取 只，均制备颈动脉内皮损伤动物模型，分别于、时随机取 只大鼠，各取损伤部位的左颈总动脉 左右，制备血管组织冰冻切片，观察动脉内膜的变化；行组织免疫荧光染色，计算、及 阳性细胞占 细胞的比例，观察损伤后 信号通路在 中的激活情况。另选取 只大鼠随机分为 组：假手
8、术组；赋形剂组：制模后在手术部位注射磷酸盐缓冲液 ；抑制剂组：术后在手术部位注射（）。术后第 周处死大鼠，取损伤动脉部位的左颈总动脉组织约 制作组织切片，苏木精伊红（）染色，光镜下观察损伤动脉的病理学改变；应用 图像分析系统进行图像质量分析，计算血管新内膜面积、中膜面积和内膜 中膜面积比。余 只大鼠随机分为对照组和 组，每组 只，均取颈总动脉外膜，分离、纯化，组的 再转染 ，观察其 和 基因及蛋白表达水平的变化。免疫荧光染色 取血管组织冰冻切片，晾干水分后室温下浸入磷酸盐缓冲液箱中浸泡 ，溶解冰冻切片包埋剂，于质量分数为 的牛血清白蛋白 磷酸盐缓冲液中室温封闭 ，滴加一抗（），湿盒内 孵育过夜
9、，磷酸盐缓冲液漂洗 次，与荧光素标记的相应二抗（）室温下孵育过夜，用磷酸盐缓冲液漂洗质量分数为的多聚甲醛，室温下固定 ，体积分数为的 室温破膜 ，磷酸盐缓冲液漂洗，与、一抗（）室温孵育 ，磷酸盐缓冲液漂洗，再与 标记的相应二抗（）室温孵育，磷酸盐缓冲液漂洗，（）室温染色约 ，磷酸盐缓冲液漂洗，甘油封片。荧光显微镜下观察，阳性细胞呈黄绿色，、阳性细胞呈橙红色，细胞核呈蓝色。的分离和培养组和对照组的健康 大鼠分离颈总动脉处外膜组织，剪成碎片，均匀铺在培养瓶底部，以含有 白血病抑制因子重组蛋白（以促进 增殖并抑制 分化）的干细胞生长培养基（含体积分数为 的胎牛血清、巯基乙醇和 青霉素 链霉素的 ）进
10、行培养。孵育 后，离心、收集细胞（即从外膜组织迁移的细胞），加入胰酶消化，收集后纯化。根据说明书，用抗 进行免疫磁珠选择以纯化分离的外膜细胞，并通过免疫荧光染色进行鉴定。通常每次取 主动脉外膜组织可获得约 个细胞。的 转染 根据说明书，将 与 转染试剂混合的转染培养基（终浓度为 ）稀释并加入到 细胞中，孵育 后，再加入等体积的 并补充 倍的胎牛血清和青霉素，孵育 。细胞在培养基中培养 后，检测、基因和蛋白表达水平。荧光定量聚合酶链反应（）检测 中、和 表达水平采用 法分离提取 的总，验证其生物纯度后逆转录合成，以合成的 片段为扩增模板进行 扩增。步骤：预变性；，退火 ；延伸退火 ；共连续 个循
11、环。引物设计：正义链：，反 义 链：；正义链：，反义链：；正义链：，反义链：；正义链：，反义链：。检测 中、和 蛋白表达水平生物学抽提法提取 总蛋白，加入蛋白酶活性抑制剂以防止其降解，蛋白质定量试剂盒测定蛋白质浓度，配置浓缩胶体和分离胶，取约 的样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，封闭，加入一抗、抗体（），均 孵育过夜，缓冲液多次洗涤，加入相应 标记的二抗（），在室温中孵育约 ；缓冲液再次漂洗。聚偏二氟乙烯（）膜上滴加增强型化学发光试剂，进行成像分析。统计学分析 使用 以及 感染、炎症、修复 年 月第 卷 第 期 进行数据统计分析。检测结果以 表示。多组间比较采用单因素方差分析（），两组之间比较
12、采用 检验。表示差异具有统计学意义。结 果 颈总动脉新内膜形成早期和晚期 信号通路在 中的表达大鼠一侧颈总动脉内皮损伤后进行光镜下观察，损伤后 可见到颈总动脉内皮损伤，损伤后、可见到新内膜上皮形成，随着时间的延长，新内膜逐渐增厚。组织免疫荧光双染色观察结果显示，在损伤修复早期（损伤后 ），的、达量明显升高（），而 的表达量未见明显升高。但在损伤修复晚期（损伤后 ），外膜中、表达量下降，中的 表达量则明显升高（）。表明，在损伤修复早期，外膜中 中的 信号通路被激活，可能起到促进血管内膜平滑肌细胞增殖的作用。而在损伤修复晚期，外膜中 的 上调，抑制 信号通路，可能起着抑制血管内膜平滑肌细胞增殖及促
13、进其凋亡的作用。见图（封二）和图。通路对血管新生内膜平滑肌细胞增殖的影响 为全面观察大鼠血管外膜 中 信号通路对动脉新生内膜形成的影响，在大鼠颈动脉内皮损伤术后，在损伤后血管外膜局部分别给予赋形剂和 信号通路阻断剂，并于损伤后约 观察血管新内膜变化。结果显示，抑制剂组与赋形剂组比较，新内膜面积和新内膜 中膜面积比均明显减少，表明在血管阻断 通路，可一定程度地抑制损伤血管新生内膜平滑肌细胞的增殖。见图（封二）和图。中 信号通路的体外研究健康 大鼠颈总动脉分离外膜中，经免疫磁珠法分离、培养、转染 后，定量 和 检测结果显示，转染 后，序列中 的 和 蛋 白 水 平 较 对 照 组 均 明 显 降
14、低，、蛋白表达量均有所上升。表明 信号通路参与了 的调控。见图。讨 论 动脉粥样硬化、移植性血管病以及冠脉介入治疗后再狭窄等血管重塑性疾病作为心血管疾病的重要分支，在发病早期有一个共同的病理特征，即血管新内膜形成（或称内膜增厚）。血管硬化狭窄或管腔内治疗失败的根本原因正是新生内膜的持续增厚。近年来，众多学者开始研究干细胞，在血管壁中也发现了干细胞的存在，并且研究证实，这些干细胞参与了血管损伤后新内膜的形成及血管的病理性重塑：血管损伤之后，于血管壁驻存的干细胞迁移并分化成为血管平滑肌细胞，然后参与新内膜的形成过程。然而，目前关于 参与血管损伤修复分子机制的研究甚少。注：与 比较：；与 比较：。图
15、 颈动脉损伤后不同时间、和 阳性细胞在 中所占比例 注：与假手术组比较：；与赋形剂组比较：。图 颈动脉内皮损伤大鼠局部给予 对血管新内膜面积（）、中膜面积（）和新内膜 中膜面积比（）的影响 ，注：表达；：电泳图；：蛋白表达。与对照组比较：。图 转染 后 信号通路 和蛋白表达的变化有研究发现，在血管损伤修复的过程中，介导的信号通路发挥着很重要的调节作用。在两种啮齿类动物血管损伤模型中均证实，外源性的 能够抑制血管新内膜形成。也可能是 信号通路的负性调节因子之一。另有研究发现，通过外膜给药的方式抑制损伤血管 的磷酸化，能够抑制新内膜的增生。但关于 信号通路是否参与调控血管外膜中干细胞的生物学行为仍
16、有待研究。血管壁上存在多种干细胞谱系，是其中之一。本研究通过建立大鼠一侧颈动脉内皮损伤动物模型，模拟人类冠脉介入治疗后再狭窄，然后以血管外膜中的 细胞为研究对象，研究 信号通路在 参与血管新内膜形成中的作用，这有可能为动脉粥样硬化及再狭窄等心血管疾病防治的药物研发提供新型候选靶点。信号通路广泛存在于各类动物细胞模型中，参与对许多重要系统生物学过程的调控。是由 调节亚基组成的异二聚体蛋白。其下游靶点 与细胞增殖的调节有关。是 信号通路上的一种负性调节抑制因子，能够直接通过减少对 通路的活化，完全阻止所有由 通路调控导致的下游信号的转导性事件。在血管中，的过表达能够抑制血小板衍生生长因子诱导的血管平滑肌细胞的增殖和迁移，并且促进血管平滑肌细胞凋亡。本研究结果表明，在血管损伤修复早期，信号通路激活，这会促进血管内膜平滑肌细胞增殖。这些增殖的血管平滑肌细胞将进一步向新内膜迁移，参与新内膜的形成。而在血管损伤修复晚期，中 上调，可抑制血管平滑肌细胞增殖，促进其凋亡，但此时，新内膜已经形成并基本稳定。在颈动脉内皮损伤术后及时通过外膜给药，阻断 信号通路，可抑制 的增殖，从而抑制新生内膜的增生。表面