1、第44卷总第131期2023年9 月西北民族大学学报（自然科学版）Journal of Northwest Minzu University(Natural Science Edition)Vol.44,No.3Sep,2023KP-10 对绵羊卵泡颗粒细胞增殖及凋亡相关基因表达的作用研究时小凤1，袁肇方1，黄一迪1巩转娣（1.西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州7 30 0 30；2.西北民族大学医院，甘肃兰州7 30 0 30)摘要目的：探讨Kisspeptin-10(KP-10)对绵羊卵泡颗粒细胞（FGCs)CCND1、CD K 6、Bc l-2、T H BS1、T NC和Bax基因
2、表达的影响.方法：将分离培养的原代FGCs细胞在含不同浓度（0、10、10 0 和10 0 0 nmol/mL)KP-10培养基中培养，分别标记为CG组、EP-1组、EP-2组和EP-3组，采用CCK-8法检测FGCs的细胞活性，筛选出KP-10对FGCs增殖的最佳浓度与时间.采用RNA-seq技术进行转录组测序分析，应用实时荧光定量PCR(qPCR)和WesternBlot方法进行验证.结果：与CG组比较，48 h时EP-2组FGCs细胞活力极显著增强（P0.01).转录组测序显示CG组和KP组间存在2 0 2 个差异表达基因，其中上调基因119个，下调基因8 3个.qPCR和Western
3、 Blot结果表明,KP组CCND1、CD K 6、Bc l-2 基因表达显著上调(P0.05);Bax、T H BS1、T NC基因表达显著下调（P0.01;P0.05),与转录组测序结果基本一致.WesternBlot验证结果与qPCR检测结果表明,KP组BAX蛋白、THBS1蛋白、TNC蛋白表达水平极显著降低（P0.01),CCND1蛋白、BCL-2蛋白和CDK6蛋白水平均显著升高（P0.05或P0.01).结论：KP-10可促进绵羊FGCs增殖及凋亡相关基因表达.KP可以降低 BAX、T H BS1、T NC m R NA 及蛋白表达，提高 CCND1、BCL-2、CD K 6 m R
4、 NA 及蛋白表达.关键词绵羊；卵泡颗粒细胞;RNA-Seq;Kisspeptin-10中图分类号S826.1文献标识码A文章编号10 0 9-2 10 2(2 0 2 3)0 3-0 0 54-0 80引言绵羊产业在我国现代畜牧业中占据重要地位，而绵羊繁殖性能的高低对绵羊的产业化规模发展有着直接影响.绵羊的季节性繁殖特性及其常见的空怀、流产等繁殖性疾病严重地阻碍了绵羊产业的发展.卵巢是成年雌性哺乳动物体内最重要的生殖器官，颗粒细胞是卵巢卵泡中最重要的体细胞之一，它可以通过自分泌和旁分泌的形式与各种细胞互相交流，在自身增殖和分化的同时，也为卵母细胞提供成熟所需的营养 1.Kisspeptin(
5、KP)是由KISS-1基因编码的一种多肽类激素，在蛋白酶的作用下水解成长短不同且具有生物活性的酰胺化肽段，包括Kisspeptin-54（K P-54）、K i s s p e p t i n-14（K P-14）、K i s s p e p t i n-13（K P-13）和Kisspenptin-10(KP-10)21.Leel3I等首次在人黑色素瘤细胞中发现了KISS-1基因,该基因具有肿瘤抑制和细胞转移能力.随后的研究发现,在哺乳类动物以及人类的卵巢组织中均存在KISS-1 和KISS-1RmRNA的表达 4.在卵母细胞、壁层颗粒细胞、颗粒细胞、黄体细胞、间质细胞以及上皮细胞中均有KI
6、SS-1和 KISS-1R mRNA表达,其中颗粒细胞KISS-1 mRNA的表达量明显高于黄体细胞、卵母细胞收稿日期2 0 2 3-0 6-12基金项目西北民族大学高原动物疾病创新团队建设项目（2 0 2 0-8 8-0 7-3）；国家自然科学基金项目（3146 0 6 8 4）通信作者巩转娣，女，主任护师，主要从事生物医学研究作者简介时小风，女，硕士研究生，主要研究方向为动物生殖生物技术研究.54一和间质细胞 5.KP-10是目前Kisspeptins多肽家族中最短的活性多肽，且在各个物种中保持着较高的同源性.通过与G蛋白偶联受体(GPR54)结合并发挥相应功能，Kisspeptins多肽
7、家族可直接调控下丘脑促性腺激素（GnRH)的释放，调控哺乳动物青春期的激活和卵巢的发育 6-7.Xiao8等研究发现,KP-10对鸡卵泡颗粒细胞的增殖和孕酮的分泌有促进作用.在猪的卵泡颗粒细胞中过表达KISS-1基因，可以将GO/G1期的细胞比例下调,并显著抑制细胞凋亡 9.然而KP-10影响FGCs细胞增殖和凋亡的具体机制尚不清楚.本研究旨在发现KP-10处理绵羊卵巢颗粒细胞后凋亡基因表达特点及其参与的信号通路,为深人发掘调控绵羊颗粒细胞调亡的关键基因,也为卵母细胞凋亡、卵泡闭锁、家畜繁殖疾病的深人研究提供理论支持 10-1.1材料与方法1.1药物与试剂DMEM/F-12无糖培养基购买于美国
8、Gibco有限公司;Kisspeptin-10购买于中科亚光生物技术（北京）有限公司；胎牛血清购自美国Hyclone有限公司；CCK-8细胞增殖检测试剂盒购自Dojindo公司；PBS缓冲液购自上海雅酶生物医药科技有限公司；TRizol购自美国Therome公司；qPCR反转录试剂盒购自湖南艾科瑞（AG)生物科技有限公司；AceQqPCRSYBRGreenMaster Mix购自于南京诺唯赞生物技术有限公司；抗体TNC、CD K 6、CCND 1、T H BS1、A CT I N、Bc l-2、Ba X、H R P-山羊抗兔均购自武汉赛维尔（Servicebio)生命科技有限公司.1.2主要仪
9、器CO2培养箱（IL-161CT，施都凯仪器设备（上海）有限公司）、超低温冰箱（BCD-251WDBD，青岛市海尔股份有限公司）、荧光定量PCR仪及化学发光仪（AriaMx，安捷伦科技有限公司），低温高速离心机（美国Thermo公司）、倒置显微镜（CKX41，奥林巴斯（深圳）工业有限公司）,RNA质量检测仪（NANO-DROP ONE,美国 Therome公司).1.3FGCs分离和培养从甘肃省武威市天祝县某屠宰场无菌采集57 月龄的初情期母羊卵巢，置于37 含有双抗的生理盐水中，4h内用保温杯带回实验室.选取卵巢表面直径2 6 mm的卵泡,采用抽吸法抽吸卵泡液.卵泡液经7 0 m(200目)
10、滤网过滤以除去卵母细胞.过滤后的悬液置于15mL离心管中10 0 0 r/mim离心8 min.弃掉上清液，细胞沉淀中添加6 mL含15%FBS的完全培养液.将细胞吹打均匀，将细胞密度调至1X10/mL，接种至6 孔板上.在37、5%COz细胞培养箱中培养 10-117.培养2 4h后用DPBS冲洗2 次，再添加新的完全培养液.选取细胞生长状况优良的FGCs，进行后续实验。1.4KP-10处理FGCs方法与分组取对数生长期的绵羊卵泡颗粒，细胞随机分为四组.依据前期的预实验和有关文献 12，选用10、100、10 0 0 n m o l/L 的KP-10,其中3个实验组分别在培养基中添加10、1
11、0 0、10 0 0 nmol/L的KP-10.空白对照组不做任何处理，分别标记为EP-1组,EP-2组、EP-3组和CG组。1.5细胞活性测定取对数生长期的FGCs细胞，按每孔4X103个细胞接种于96 孔板中，按照1.4添加不同浓度KP-10.每组设5个重复孔，严格按照CellCountingKit-8（C C K-8)使用说明操作.在2 4h、48 h 和7 2 h分别测定450 nm处的吸光度（OD值），重复测定3次.1.6?cDNA建库和 Illumina测序根据CCK-8法细胞活力检测结果，筛选出KP-10对颗粒细胞增殖影响最佳浓度与最佳作用时间进行细胞培养.将细胞收集于无菌EP管
12、中，干冰保存运输.样品检测、文库构建、质量控制和上机测序均由北京百迈客生物科技有限公司进行.1.7测序结果比对与差异基因分析统计和评估测序得到的原始序列，去除不符合要求的序列，使得Q30（即基因测序质量，Sequencing5一一55表1引物序列Quality,是指基因检测的质量有30 位,即每一行的DNA核苷酸序列有30 个测序的位点是正确的.基因检测的Q30得分越高，测序的质量就越高，所获得的结果就越准确和可信)达到8 0%以上，得到高质量的纯净序列.用To-phat软件将质控后的高质量序列与NCBI数据库中的绵羊基因组进行比对.对不同处理组进行重复相关性评估，用DESeq进行样品组间的差
13、异表达分析.通过KOBAS(2.O）从生物过程（BP）、分子功能(MF)及细胞成分(CC)等方面进行差异表达基因的Gene Ontology(GO)功能富集分析,对差异表达基因进行KEGG信号通路富集分析，P0.05被认为显著富集，可进行信号通路的富集分析.1.8实时荧光定量PCR(qPCR)将CG组和EP-2组FGCs以1X105/mL接种至6 孔板上，每组设3个重复，培养48 h后用TR-izol法提取FGCs的总RNA并逆转录成cDNA，选择与细胞增殖和凋亡的相关基因（CCND1、CD K 6、Bcl-2、T H BS1、T NC 和Bax)作为验证基因.以GenBank中绵羊的基因序列
14、为依据，用Primer Premier设计PCR引物，引物均由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成.引物具体信息见表1.PCR反应体系20L.PCR反应条件：预变性956 0 s；变性955s;退火6 0 30 s，共40 个循环.每个样品3次重复.检测结果用2-Ct法进行统计分析.1.9Western Blot 验证收集培养的FGCs用PBS冲洗细胞2 3次，加人适当体积的RIPA裂解液于培养瓶内35min，使试剂与细胞充分接触进行裂解.用5%浓缩胶SDS-PAGE凝胶蛋白电泳，30 0 mA恒流、30 min转移至PVDF膜上.将转印完的膜放人装有TBST的孵育槽中，然后加上5%的牛奶，放置脱
15、色摇床室温下封闭30 min.分别加人配置好的抗Bcl-2抗体（1：10 0 0）、抗-Bax抗体（1：10 0 0）、抗PI3K抗体（1：10 0 0）、抗-pan-AKT抗体（1：10 0 0)及-actin（1：150 0）等一抗，4孵育摇床过夜，然后加人羊抗免IgG(1：50 0 0)二抗，孵育30 min.采用ECL化学发光试剂进行印迹.蛋白的相对含量表示灰度值与内参灰度值的比值.阴性对照组不加一抗，重复3次实验.在暗室中进行曝光拍照.每组实验重复3次，用Image软件分析各条带灰度值。基因F:TGGCATCGTGGAGGGACTTAGAPDHR:CATCATACTTGGCAGGTT
16、TCTCCF:CGCCCTCGGTGTCCTACTTCCCND1R:GACCTCCTCCTCGCACTTCTGF:TGCTGCTTCTCATCCTCCTCTGCDK6R:GTGATTGGTGTCCTGACTGTTCTCF:CCTTTGTGGAGCTGTATGGCBcl-2R:ACTTATGGCCCAGATAGGCAF:GTGCCTGACAAGAAGTTCCAAGACTHBS1R:GGAGACCACGCTGAAGACCTGF:GCTACGGAGGTTCAGTCGGAATCTNCR:GTCAGGCTGTAAGAGGTGGTGTCF:GCCCTTTTGCTTCAGGGTTTBaxR:TCAGACACTCGCTCAGCTTC1.10数据分析ImageJ软件分析Westernblotting蛋白条带的灰度值，用GraphPadPrism8.O软件作图分析.实验数据采用Excel分析并进行处理，组间差异比较选择SPSS21.0统计软件进行独立样本t检验，结果用“平均值土标准差”表示,P0.05表示组间差异显著，P0.01表示组间差异极显著.2结果2.1KP-10对绵羊FGCs活力的影响CCK8检测