1、360 2023,Vol.44,No.14 食品科学 安全检测超高效液相色谱-串联质谱法测定动物源性 食品中的13 种利尿剂任晓伟，范力欣，何亮娜，孙 磊*，马俊美*（河北省食品安全重点实验室，国家市场监管重点实验室（特殊食品监管技术），特殊食品安全与健康河北省工程研究中心，河北省食品检验研究院，河北 石家庄 050000）摘 要：使用超高效液相色谱-串联质谱建立测定动物源性食品中13 种利尿剂的方法。样品经乙腈或90%乙腈溶液提取和PRiME HLB通过式固相萃取柱净化后使用ACQUITY HSS T3色谱柱（100 mm2.1 mm，1.8 m）分离，流动相分别为乙腈和5 mmol/L乙酸
2、铵溶液，梯度洗脱。在电喷雾正/负离子同时扫描的模式下进行定性和定量的检测。结果表明：13 种利尿剂线性关系良好，相关系数均达0.997 0以上。定量限范围为2.05.0 g/kg。方法回收率范围为68.3%118.0%，相对标准偏差为0.47%9.5%（n=6）。本方法简便准确，实用性强，可用于对利尿剂的快捷、精准检测。关键词：超高效液相色谱-串联质谱；利尿剂；固相萃取柱；动物源性食品Determination of 13 Diuretics in Animal-Derived Foods by Ultra-high Performance Liquid Chromatography-Tand
3、em Mass SpectrometryREN Xiaowei,FAN Lixin,HE Liangna,SUN Lei*,MA Junmei*(Hebei Food Safety Key Laboratory,Key Laboratory of Special Food Supervision Technology for State Market Regulation,Hebei Engineering Research Center for Special Food Safety and Health,Hebei Food Inspection and Research Institut
4、e,Shijiazhuang 050000,China)Abstract:A novel efficient and accurate ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS)method for the detection of 13 diuretics in animal-derived foods was developed.The samples were extracted with acetonitrile or 90%acetonitrile solution
5、 and cleaned up on a PRiME HLB pass-through solid phase extraction(SPE)column.Then,an ACQUITY HSS T3 column(100 mm 2.1 mm,1.8 m)was used for chromatographic separation by gradient elution using a mobile phase consisting of 5 mmol/L aqueous ammonium acetate and acetonitrile,and an electrospray ioniza
6、tion source(ESI)operated in both positive and negative ion scanning modes with multiple reaction monitoring(MRM)was used to detect the diuretics qualitatively and quantitatively.The results showed that the calibration curves for all the analytes exhibited good linearity with correlation coefficients
7、 above 0.997 0.The limits of quantification ranged from 2.0 to 5.0 g/kg.The recoveries of the proposed method ranged between 68.3%and 118.0%,with relative standard deviations(RSDs)between 0.47%and 9.5%(n=6).This method is a fast,simple,accurate,and practical one for the detection of diuretics.Keywor
8、ds:ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry;diuretics;solid phase extraction cartridge;animal-derived foodsDOI:10.7506/spkx1002-6630-20220715-177中图分类号：O657.63 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2023）14-0360-08收稿日期：2022-07-15基金项目：河北省技术创新引导计划项目（21475501D）第一作者简介：任晓伟（1995）（ORCID:0000-00
9、01-5464-3093），女，助理工程师，硕士，研究方向为食品安全。E-mail:*通信作者简介：孙磊（1986）（ORCID:0000-0002-6771-1291），男，高级工程师，硕士，研究方向为食品安全。E-mail:马俊美（1990）（ORCID:0000-0002-3126-5023），女，高级工程师，硕士，研究方向为食品安全。E-mail:安全检测 食品科学 2023,Vol.44,No.14 361引文格式：任晓伟,范力欣,何亮娜,等.超高效液相色谱-串联质谱法测定动物源性食品中的13 种利尿剂J.食品科学,2023,44(14):360-367.DOI:10.7506/sp
10、kx1002-6630-20220715-177.http:/ REN Xiaowei,FAN Lixin,HE Liangna,et al.Determination of 13 diuretics in animal-derived foods by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometryJ.Food Science,2023,44(14):360-367.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220715
11、-177.http:/利尿剂是作用于肾脏，增加电解质和水排出的能够产生利尿作用的一类药物1，在临床上广泛应用于利尿消肿、降压和脑水肿等治疗2-5。利尿剂因为具有很强的排尿能力在需要快速减肥才能达到某一体质量类别的运动中经常被滥用。利尿剂还可以作为掩蔽剂增加尿量，从而稀释一些违禁兴奋剂的浓度，使这些违禁兴奋剂的检测变得更加困难。例如呋塞米和布美他尼等高效利尿剂可使尿液中兴奋剂的浓度降低45 倍6。此外，碳酸酐酶抑制剂组的利尿剂会导致尿液呈碱性，从而抑制碱性兴奋剂的排泄，导致兴奋剂的阴性分析6-9。1988年汉城奥运会期间，4 名运动员的利尿剂速尿检测呈阳性。1988年另一种引起广泛关注的利尿剂丙
12、磺舒，它能有效减少合成类固醇和抗生素的排泄，使尿液中的类固醇浓度降低至原来的十分之一。因此在使用丙磺舒后对合成类固醇和抗生素的准确分析难度较大。自1988年，国际奥委会禁止在冬季和夏季奥运会上使用不同种类的利尿剂。另外，利尿剂还被应用到动物饲养当中，用于治疗奶牛乳房炎，或者是改善禽蛋蛋白比例等10。这会使利尿剂在动物体内存在残留。运动员误食这些食品后不仅会对身体健康产生负面影响，也会造成尿检阳性事件。所以开发出一种灵敏、简捷的检验食品中违禁利尿剂的分析技术手段刻不容缓。由于动物源性食品中利尿剂的微量存在和显著的基质效应，前处理过程在仪器分析之前至关重要。为了获得更好的分析准确度，需要去除样品基
13、质中的干扰。在以往的一些研究中，利尿剂的净化方法主要是液-液萃取（liquid-liquid extraction，LLE）和常规的固相萃取（solid phase extraction，SPE）11-14。这些方法往往需要较长的提取时间，大量的溶剂和繁杂的后续步骤。本实验中使用PRiME HLB通过式固相萃取柱净化。PRiME HLB通过式固相萃取柱是近年来发展起来的一种直通型SPE固相萃取柱15-18。它将提取、浓缩、净化融为一体，不仅能有效去除样品基质中的脂肪和磷脂类化合物等杂质，而且使用前无需活化和平衡19。直通型SPE固相萃取柱既精简了实验的前处理过程，又提高了分析准确度。目前，利尿
14、剂的检测主要针对人及动物的尿样、保健品和饲料等样品，方法有薄层色谱（thin-layer chromatography，TLC）法20、循环伏安法21、胶束液相色谱法22、液相色谱（liquid chromatography，LC）法23-24、液相色谱-质谱（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）法25-28、气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法29-30等。其中LC-MS和GC-MS是两种比较常见的方法。但是在使用GC-MS法对利尿剂进行分析时，为提高利尿剂的挥发性，在
15、GC-MS分析前需要对样品进行甲基化或硅烷化等衍生化处理16。而衍生化处理包含许多实验步骤，前处理过程比较复杂。超高效液相色谱-串联质谱（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）不仅不用衍生化的处理，而且灵敏度高、准确度好、应用广泛。因此，本实验开发出了一种直通型SPE联合内标法检测13 种利尿剂的新型UPLC-MS/MS方法。该方法简单高效、精密度好、重复性好和特异性强，适用于动物源性食品中13 种利尿剂的批量、准确检测。1 材料与方法1.1 材料与试剂鸡蛋、牛奶、鸡肉和
16、猪肉食品样品来源于本地农贸市场，均未检出实验中涉及的13 种利尿剂。氨苯蝶啶、螺内酯、坎利酮、乙酰唑胺、4-氨基-6-氯苯-1,3-二磺酰胺、氯噻嗪、氢氯噻嗪、氯噻酮、呋塞米、苄氟噻嗪、托拉塞米、坎利酮-D6、氢氯噻嗪-13C-D2、呋塞米-D5、乙酰唑胺-D3、氯噻酮-D4、苄氟噻嗪-D5、氨苯蝶啶-D5、氯噻嗪-13C15N2、丙磺舒-D14、4-氨基-6-氯苯-1,3-二磺酰胺-N2、托拉塞米-D7标准物质（纯度大于95%）天津ALTA科技有限公司；丙磺舒标准物质（纯度95%）CATO Research Chemicals公司；托伐普坦、托伐普坦-D7标准物质（纯度95%）加拿大 TLC PharmaChem有限公司；乙腈、甲醇、正己烷（均为色谱纯）美国Millipore公司；甲酸（色谱纯）美国Sigma公司；乙酸铵（纯度98%）上海麦克林生化科技有限公司；超纯水 屈臣氏商标有限公司；Oasis PRiME HLB固相萃取柱（200 mg/6 mL）美国Waters公司。1.2 仪器与设备TSQ Quantiva UPLC-MS/MS仪 美国Thermo公司；Elmasonic