1、基金项目:江苏省苏州市科技发展计划项目(SZS2020310)作者单位:215000苏州大学附属儿童医院感染性疾病科(王坤、田健美、孔小行、成芳芳、李嫣);210029南京医科大学第一附属医院感染病科(朱传龙)通信作者:李嫣,电子信箱:liyan0079 miR-204-5p 靶向调控 BCL2L2 促进急性肝衰竭大鼠肝细胞凋亡的研究王坤朱传龙田健美孔小行成芳芳李嫣摘要目的探讨 miR-204-5p 在急性肝衰竭大鼠肝组织中的表达情况及其促进肝细胞凋亡的的作用及潜在机制。方法根据随机数字表法将 32 只 SD 大鼠分为 4 组,即对照组(0h)、模型组(24、48、72h),每组 8 只。模型
2、组腹腔注射 D-氨基半乳糖联合脂多糖诱导急性肝衰竭,对照组为腹腔内注射等量的 0.9%氯化钠溶液。分别取对照组及模型组造模完成后 24、48、72h 大鼠静脉血及肝组织,ELISA 检测血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸基转移酶(aspartate amin-otransferase,AST)、总胆红素(total bilirubin,TBIL)的水平,通过 HE、TUNEL 染色法行肝组织病理学检查和肝细胞凋亡观察。生物信息学工具预测 miR-204-5p 的靶基因,采用双荧光素酶报告基因实验验证两者的靶向关系。RT-PCR 和 Wes
3、tern blot 法检测肝组织中 miR-204-5p、BCL2L2 的表达情况。结果与对照组比较,模型组随着造模时间的延长,ALT、AST、TBIL 值逐渐升高,肝组织坏死程度、炎性细胞浸润逐渐加重,肝细胞凋亡指数逐渐升高。RT-PCR 结果显示,随着造模时间的延长,miR-204-5p基因的相对表达水平逐渐升高,而 BCL2L2 基因的相对表达水平逐渐降低;Western blot 法检测结果亦显示,BCL2L2 蛋白表达水平逐渐降低(P 均 0.05)。miR-204-5p 和 BCL2L2 之间存在靶向关系,miR-204-5p 能够靶向调控 BCL2L2 表达。结论miR-204-
4、5p可能通过靶向调控 BCL2L2 促进肝细胞凋亡,进而促进急性肝衰竭疾病的发生、发展。关键词急性肝衰竭微小 RNA-204-5pBCL2L2凋亡中图分类号R575.3文献标识码ADOI 10.11969/j.issn.1673-548X.2023.07.027Study on miR-204-5p Promotes Hepatocyte Apoptosis in Acute Liver Failure Rats by Targeting BCL2L2.WANG Kun,ZHU Chuan-long,TIAN Jianmei,et al.Childrens Hospital of Soocho
5、w University,Jiangsu 215000,ChinaAbstractObjectiveTo explore the expression of miR-204-5p in liver tissue of rats with acute liver failure,as well as its rolein promoting hepatocyte apoptosis and potential mechanisms.MethodsThirty-two SD rats were randomly divided into four groupscontrol group(0h),m
6、odel groups(24h,48h and 72h),each group had eight rats.Model groups were intraperitoneally injected withD-galactosamine(D-GaIN)and lipopolysaccharide(LPS),while rats in the control group were injected with equal amount of saline.The venous blood and liver tissue of rats were obtained in the control
7、group and the model groups which were taken in 24hours,48hoursand 72hours after the completion of the model.The levels of serum alanine aminotransferase(ALT),aspartate aminotransferase(AST),total bilirubin(TBIL)were tested by Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).The pathological change of liver
8、tissue was exam-ined by HE staining and the apoptosis was observed by TUNEL.Bioinformatics tools were used to predict the target gene of miR-204-5p,and the dual luciferase reporter gene experiment was used to verify the targeting relationship.RT-PCR and Western blot were usedto detect the levels of
9、miR-204-5p,BCL2L2 in the liver tissues.ResultsCompared with the control group,with the prolongation ofmodeling time,the level of ALT,AST and TBIL in the model groups gradually increased.The degree of liver tissue necrosis and inflam-matory cell infiltration gradually aggravated,and the apoptotic ind
10、ex of hepatocyte gradually rose.The results of RT-PCR showed thatwith the prolongation of modeling time,the relative expression level of miR-204-5p in liver tissue was upregulated,while BCL2L2 wasdownregulated.Western blot showed that the expression level of BCL2L2 protein decreased gradually(all P
11、0.05).There is a targetingrelationship between miR-204-5p and BCL2L2,indicating that miR-204-5p can target the expression of BCL2L2.ConclusionmiR-204-5p promotes hepatocyte apoptosis by targeting BCL2L2,which promoting the occurrence and development of acute liver failure.Key wordsAcute liver failur
12、e;miR-204-5p;BCL2L2;Apoptosis631论著J Med Res,July 2023,Vol.52 No.7急性肝衰竭(acute liver failur,ALF)是由各种病原体感染,各种物质中毒等原因引起的肝细胞亚大片或大片凋亡、坏死,致使其各种生物学功能严重受损或失代偿的一种临床症候群,临床病死率高1。由于缺乏理想的早期病情评估指标和有效的药物治疗方案,急性肝衰竭的临床评估与有效治疗仍然是世界性的难题2。目前急性肝衰竭常用的治疗方法为内科治疗,包括保肝、呼吸循环支持、血浆置换等治疗,但疗效仍有限3。肝移植仍是当前该疾病最有效的治疗方法,但由于供肝缺乏、医疗费用高昂等
13、问题限制该方法的广泛开展4。因此,进一步寻找一种新的方式早期诊断评估、治疗急性肝衰竭至关重要。有研究表明,基因治疗是一种很有前途的治疗方式,可用于治疗多种疾病,并且能提高治疗的疗效和患者的生存率5。微小 RNA(miRNA)是一类小分子非编码单链RNA,由约 22 个核苷酸组成,它通过与 mRNA 的3-非转录区域(3-UTR)结合,在转录或转录后水平调控靶基因的功能,抑制靶基因的表达,在调控体内的蛋白质编码基因的表达中发挥重要作用6。既往研究表明,miRNA 不仅可以作为肝衰竭的早期诊断指标,也在肝衰竭炎性反应、肝细胞坏死、凋亡和肝细胞再生过程中发挥着重要的调控作用7。因此,通过探索这些 m
14、iRNAs,可能会获得疾病早期诊断和靶向治疗的新线索。材料与方法1.实验动物:雄性 SD 大鼠 42 只,6 周龄,体质量为 200 220g,购自上海斯莱克实验动物有限责任公司,许可证号:SCXK(沪)2017-0005。本实验中所有的实验动物被饲养于苏州大学动物实验中心,SPF 级饲养环境,动物实验经苏州大学实验动物伦理委员会批准进行,实验动物使用许可证:SYXK(苏)2017-0043。2.主要实验试剂:D-氨基半乳糖、脂多糖购自美国 Sigma 公司;丙氨酸氨基转移酶(alanine amin-otransferase,ALT)检测试剂盒、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate ami
15、notransferase,AST)检测试剂盒及总胆红素(total bilirubin,TBIL)检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所;TRIzol 购自美国 Invitrogen 公司;cDNA 第一链合成试剂盒购自日本 TaKaRa 公司;全蛋白抽提试剂盒、BCA 蛋白含量检测试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司;兔 anti-BCL2L2、羊抗兔 IgG-HRP 购自江苏亲科生物研究中心有限公司;引物、miR-204-5p 模拟物(miR-204-5p mim-ic)、pmirGLO-BCL2L2-WT、pmirGLO-BCL2L2-MUT报告载体均由江苏凯基生物技术股份有限公司构
16、建完成。3.急性肝衰竭大鼠模型建立、分组:取 32 只 6 周龄雄性 SD 大鼠,以随机数字表法平均分成对照组(0h)、模型组(24h)、模型组(48h)、模型组(72h),每组各 8 只模型组(72h)的大鼠在造模不足 72h 有死亡的情况,此时再随机选取 6 周龄雄性 SD 大鼠补充入组,完成造模,对照组腹腔注射 0.9%氯化钠溶液,模型组采用 D-氨基半乳糖(D-GalN,剂量为950mg/kg)和脂多糖(LPS,剂量为 10g/kg)依次腹腔注射制造大鼠急性肝衰竭模型,分别取对照组及模型组造模完成后 24、48、72h 大鼠静脉血及肝组织。另取 10 只 6 周龄雄性 SD 大鼠,行上述急性肝衰竭造模后,观察大鼠生存情况。4.酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清 ALT、AST、TBIL 值:内眦静脉采取 4 组大鼠静脉血,采血完成后,置于离心机中,4、3000r/min 离心 10min。收集上层血清,严格 按照试 剂 盒 所 附 说 明 书 的 操 作检测。5.苏木精-伊红(HE)染色观察各组大鼠肝组织病理变化及行炎症活动指数(histology activity ind