1、74江西中医药大学学报 2023 年 8 月第 35 卷第 4 期JOURNAL OF JIANGXI UNIVERSITY OF CM 2023 Vol.35 No.4中药研究UPLC-MS/MS 法测定右归丸中毛蕊花糖苷的含量 邓杰华1 周云峰1 黄招光1 吴喆1 黄炳泉1 李存金2（1.宜春市检验检测中心 江西 宜春 336000；2.江西省药品检查员中心 南昌 330029）摘要目的：建立右归丸中毛蕊花糖苷的含量测定方法。方法：采用 Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm100 mm，1.7 m），以乙腈-0.1%甲酸溶液为流动相，梯度洗脱，流速 0
2、.3 mL/min，柱温 30 ；质谱条件以 623 161 和 623 133为特征离子对，采用电喷雾离子源（ESI）和负离子扫描方式，进行多反应离子监测（MRM）定量分析。结果：毛蕊花糖苷在质量浓度 175.739 21 757.392 0 ng/mL 范围内呈良好线性关系，方法学考察良好。9 批样品中毛蕊花糖苷的含量范围为33.4053.20 g/g。结论：所建方法能测定右归丸中熟地黄的主要化学成分的含量，可用于右归丸的质量控制。关键词右归丸；熟地黄；毛蕊花糖苷；液质联用；含量中图分类号：R284.1 文献标志码：AThe Content Determination of Verbasc
3、oside in Yougui Pills by UPLC-MS/MSDENG Jie-hua1,ZHOU Yun-feng1,HUANG Zhao-guang1,WU Zhe1,HUANG Bing-quan1,LI Cun-jin2 1.Yichun Inspection and Testing Center,Yichun 336000,China;2.Jiangxi Drug Inspection Center,Nanchang 330029,China.Abstract Objective:To establish a method for the content determinat
4、ion of verbascoside in Yougui pills.Methods:The liquid chromatography was performed using acetonitrile-0.1%formic acid as mobile phase in gradient elution at a flow rate of 0.3 mL/min and column temperature of 30.The mass spectrometry conditions were characterized by ion pairs 623161 and 623133,elec
5、trospray ion source and positive ion scanning,and multiple reactive ion monitoring(MRM)quantitative analysis.Results:A good linear relationship was found in the mass concentration range of 175.739 2-1 757.392 0 ng/mL.The content of verbascoside in 9 batches of samples ranged from 33.40 g/g to 53.20
6、g/g.Conclusion:The method can be used to determine the content of main chemical components of Radix rehmanniae praeparata in Yougui pills and to control the quality of Yougui pills.Key words Yougui Pills;Radix Rehmanniae Praeparata;Verbascoside;UPLC-MS;Content基金项目：江西省药品监督管理局科研项目（2019JS24）。通信作者：李存金，副
7、主任药师。E-mail:。右归丸为温补肾阳的经典名方，始载于景岳全书1-2，现收录于 2020 年版中国药典3，由熟地黄、菟丝子、炮附片、山药、酒萸肉、当归、肉桂、鹿角胶、枸杞子、盐杜仲 10 味中药组成。方中熟地黄、酒萸肉、枸杞子、山药滋阴益肾，养肝补脾，填精补髓，取“阴中求阳”之义，共为臣药4，其中熟地黄具有治疗肝肾阴虚、盗汗遗精等作用5。熟地黄的有效成分主要是毛蕊花糖苷6-7，而右归丸现行药典标准中无毛蕊花糖苷的检测方法，查阅文献也几无相关报道，这不利于方中熟地黄的质量控制。为此，本研究采用液质联用技术建立右归丸中毛蕊花糖苷的测定方法，为方中熟地黄的含量测定以及质量控制提供参考。1 仪器
8、与试药WatersAcquityUPLCH-class/xevoTQD 液相色谱质谱 联 用 仪（美 国 waters 公 司）；PL-S60 超 声波清洗仪（东莞康士洁超声波科技有限公司）；MS205DU 电子天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）。右归丸（均来自市场监督抽样，生产企业为仲景宛西制药股份有限公司，规格为 0.18g/丸）；毛蕊花糖苷对照品（批号：111530-201914，纯度：95.2%，购于中国食品药品检定研究院）；乙腈和甲酸为质谱级；甲醇为色谱级；水为纯化水。2 方法与结果2.1 色谱、质谱条件色谱柱：WatersACQUITYUPLCBEHC18（2.1mm75陈颖等
9、：彭涛从少阳论治胃癌前病变经验中药研究100mm，1.7m）；流速：0.3mL/min；柱温：33；样品室温度：10；进样量：5L；流动相：A 乙腈，B0.1%甲酸溶液，梯度洗脱程序：02min，20%A20%A；28min，20%A80%A。采用多反应监测（MRM）模式，电喷雾离子源（ESI），温度 150，扫描方式为负离子模式，毛细管电压0.5kV，锥孔气流量60L/h，脱溶剂气流量1000L/h，脱溶剂气温度 600，其他参数见表 1。表1 质谱参数化合物分子式分子量 M母离子子离子毛细管电压/kV锥孔电压/V碰撞能量/V毛蕊花糖苷C29H36O156246231330.56166M-H
10、-161*0.56134注：*为定量离子。2.2 溶液的配制2.2.1 对照品溶液 精密称取毛蕊花糖苷 9.23mg，置100mL量瓶中，加甲醇溶解配制成含87.8696g/mL的对照品储备液。精密量取对照品储备液 2mL，置 100mL量瓶中，加甲醇溶解配成含1757.3920ng/mL的对照品母液。精密量取对照品母液 5、10、15、25mL，分别置于50mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成含有 175.7392、351.4784、527.2176、878.6960ng/mL 一系列浓度的对照品溶液。2.2.2供试品溶液样品剪碎后，称取约 1g，精密称定，置于 50mL 量瓶中，加入
11、 50%甲醇溶液40mL，振摇 5min 后静置 1h，常温超声处理（功率 250W，频率 50kHz）30min，放冷，加 50%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，采用 0.22m 的有机滤膜滤过，取续滤液，即得。2.2.3阴性样品溶液精密称取不含熟地黄的右归丸约 1g，按“2.2.2”项下供试品溶液的处理方法制备阴性样品溶液。2.2.4 空白溶液 不加样品，按“2.2.2”项下供试品溶液的处理方法制备空白溶液。2.3 标准曲线依次吸取质量浓度为 175.7392、351.4784、527.2176、878.6960、1757.3920ng/mL 对照品溶液各 5L，按“2.1”项条件进样测定，以对
12、照品浓度为横坐标（X），以峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，标准曲线方程为 Y=1838.2X+5077.3，R2=0.9985。结果表明，毛蕊花糖苷的浓度与峰面积呈良好的线性关系。2.4 专属性取“2.2”项下制备的溶液各 5L，分别进样测定，采集到的 MRM 的 TIC 图见图 1。结果表明，供试品溶液出现与对照品溶液保留时间一致的色谱峰，且阴性样品溶液和空白溶液对测定无干扰，专属性良好。2.5 精密度取浓度为 527.2176ng/mL 的毛蕊花糖苷对照品溶液，连续进样 6 次，记录峰面积，毛蕊花糖苷峰面积的 RSD 为 1.52%，仪器精密度良好。2.6 重复性取 6 份样品（批号：1
13、91207），每份约 1g，按“2.1”项下方法制备样品溶液，吸取 5L 注入仪器中，毛蕊花糖苷含量的 RSD 为 2.9%，所测结果符合重复性要求。2.7 稳定性取制备好的供试品溶液（批号：191207），在 0、1、2、4、6、8h 测定峰面积，计算含量，RSD 为 3.3%，表明样品在 8h 内稳定性较好。2.8 加标回收率称取已知含量的样品 9 份（批号：191207），每份约 1g，置 50mL 量瓶中，分别精密加入毛蕊花糖苷对照品储备液（87.8696g/mL）0.2、0.4、0.5mL，按“2.2.2”项下方法制得低、中、高 3 个质量浓度的加标回收溶液，按“2.1”项下检测条件
14、测定，回收率见表 2，结果表明该方法回收率良好，准确度较高。表2 加标回收率结果编号取样量/g样品含量/g加入量/g测得量/g加标回收率/%平均回收率/%RSD/%11.023434.3217.5750.5592.3798.303.9621.124537.7117.5755.0198.4631.046735.1017.5751.6494.1440.998733.4935.1570.52105.3551.036234.7535.1568.1695.0560.999433.5235.1569.41102.1171.087636.4743.9380.69100.6681.042234.9543.93
15、77.5897.0491.053835.3443.9379.0899.57邓杰华等：UPLC-MS/MS 法测定右归丸中毛蕊花糖苷的含量76江西中医药大学学报 2023 年 8 月第 35 卷第 4 期中药研究A.空白溶剂；B.阴性样品；C.样品；D.毛蕊花糖苷对照品。图1 MRM色谱图2.9 样品结果取 9 批样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱、质谱条件测定，记录峰面积并代入标准曲线方程计算含量，各样品中毛蕊花糖苷的含量结果见表 3，每批样品平行测定 2 次，毛蕊花糖苷含量范围为 33.4053.20g/g。表3 含量测定结果 g/g样品批号含量1905023
16、9.6719030234.6619090344.0619110138.1518120542.9019120433.4019070353.2019120733.5419050342.563 讨论右归丸的现行药典标准采用显微鉴别法对熟地黄进行质量控制，但显微鉴别只能定性而不能定量，对于用提取过的药渣投料、掺伪投料等行为无法准确甄别，需要联合含量测定法进行质量控制。本研究采用 UPLC-MS/MS 法对处方中熟地黄的代表性有效成分毛蕊花糖苷进行含量测定，以提升右归丸的质量标准。在进行供试品提取方法的考察时，考虑蜜丸中炼蜜的影响，在加入提取溶剂后先振摇 5min 再静置 1h，使蜜丸充分溶散后，再超声处理；而超声时间考察了 10、20、30、40、50min，结果超声 30min后提取相对完全，故最终确定采用 50%甲醇先振摇 5min 并静置 1h，再超声 30min 制备供试品溶液。在进行色谱质谱条件考察时，考察了甲醇-5mmol/L 乙酸铵、甲醇-0.1%甲酸、乙腈-5mmol/L乙酸铵和乙腈-0.1%甲酸 4 个流动相体系，通过比较被测物的保留时间、峰形、分离度和耐用性，最终选择了乙腈