1、第35卷 第 2期2023年6月塔里木大学学报Journal of Tarim UniversityVol.35 No.2Jun.2023文章编号：1009-0568（2023）02-0060-07阿克苏地区某规模化猪场猪流行性腹泻的诊断和疫苗效果评价邢潇月1,2,3，刘洋1,2,3，李虎1,2,3，胡亚辉1,2,3，刘祥杰1,2,3，张家浩1,2,3，李莲瑞1,2,3*（1 塔里木大学动物科学与技术学院，新疆 阿拉尔 843300）（2 塔里木畜牧科技兵团重点实验室，新疆 阿拉尔 843300）（3 新疆生产建设兵团塔里木动物疫病诊断与防控工程实验室，新疆 阿拉尔 843300）摘要2021
2、年1月阿克苏地区某规模化猪场腹泻病爆发，采用猪腹泻胶体金试剂盒检测发病仔猪腹泻物，结果显示猪流行性腹泻病毒（PEDV)阳性率为100%。为探究其原因，于2021年112月采集该猪场6 567份猪肛拭子，通过实时荧光定量法检测不同月份PEDV的感染情况，为防控猪流行性腹泻（PED），选用TGE-PED二联弱毒苗和灭活苗对妊娠85 d和105 d母猪进行联合免疫，应用间接ELISA法监测妊娠母猪的IgG、IgA抗体水平，并对该场PEDV疫苗免疫效果进行评价。结果显示PEDV的检出率在1月、2月、11月、12月较高，其余月份较低；妊娠母猪PEDV的抗体IgG和IgA抗体阳性率在产前15 d和分娩当天
3、均达到了100%，离散度小于40%，免疫效果较好；产前1 d各批次PEDV的IgG抗体阳性率仍达到100%，但IgA抗体阳性率有不同程度下降，且离散度有不同程度升高，推测母猪可能存在排毒情况。本研究为该猪场PED防控提供了理论依据。关键词猪流行性腹泻；荧光定量PCR；PEDV；免疫抗体中图分类号：S855.3文献标识码：ADOI：10.3969/j.issn.1009-0568.2023.02.007Detection of PED and evaluation of vaccine effect in alarge-scale pig farm in Aksu areaXING Xiaoyu
4、e1,2,3，LIU Yang1,2,3，LI Hu1,2,3，HU Yahui1,2,3，LIU Xiangjie1,2,3，ZHANG Jiahao1,2,3，LI Lianrui1,2,3*(1 College of Animal Science and Technology,Tarim University,Alar,Xinjiang 843300)（2 Key Laboratory of Tarim Animal Husbandry Science and Technology,Xinjiang Production&ConstructionCorps.Alar,Xinjiang 8
5、43300)(3 Engineering Laboratory of Tarim Animal Diseases Diagnosis and Control,Xinjiang Production&Construction Corps.Alar,Xinjiang 843300)AbstractIn January 2021,a large-scale pig farm in Aksu area experienced an outbreak of diarrhea.A colloidal gold reagent kitwas used to detect the diarrhea produ
6、cts of infected piglets,and the results showed that the positive rate of porcine epidemic diarrheaviru(PEDV)reached 100%.To investigate the cause,6 567 pig anal swabs were collected from the pig farm from January to Decem-收稿日期：2022-06-28基金项目：新疆生产建设兵团科技特派员创新创业项目“阿拉尔规模化猪场疫病防控预警系统的构建及推广示范”（2018CB037）第一
7、作者：邢潇月（1998-），女，2021级在读硕士研究生，研究方向为动物性食品卫生与安全。E-mail：*通信作者：李莲瑞（1968-），女，博士，教授，研究方向为动物性食品安全与检测、基因组学。E-mail：第 2期猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea vi-rus，PEDV）引起的一种急性、高度传染性肠道疾病1，主要临床症状为呕吐、水样腹泻，还会出现厌食、脱水、消瘦、酸中毒、死亡率高2等症状。不同年龄段猪均可发生PED，但以哺乳期仔猪多发，特别是出生5日龄内的仔猪，哺乳仔猪感染后死
8、亡率甚至高达 100%3。PEDV除了通过粪口传播、母乳传播之外，在王新平等4的研究中还发现PEDV可以通过呼吸道传播。近年来，随着集约化养殖的发展，大型规模化猪场越来越多，猪流行性腹泻对猪养殖业造成严重经济损失。PEDV最早于1971年发现于英国5，上海兽医研究所1983年分离出曾在我国上海流行的猪流行性腹泻病毒株6；2010年冬季，PEDV再次在我国华南地区部分猪场爆发并迅速席卷全国，给生猪养殖业造成巨大损失7。通常采用灭活苗和弱毒苗进行免疫来实现PEDV的防控，灭活苗安全性高、制作简单、易于保存和运输，但该类疫苗还存在免疫持久性短、体内的抗原浓度无法维持等缺点8；弱毒苗产生抗体快，能够刺
9、激机体产生持续免疫力，但存在储存条件苛刻等缺点9。猪流行性腹泻病与猪轮状病毒、猪传染性胃肠炎临床症状相似，仅依靠病理变化难以作出诊断，可通过病原学、血清学以及分子生物学进行诊断10-11。目前常用于生产中的能够快速、准确判断PED的方法为实时荧光定量法12。阿克苏地区某规模化猪场爆发以腹泻为主要症状的高致死率疾病，应用RT-PCR和胶体金检测确定病原是否为PED，注射疫苗对其进行防控，并采用ELASA方法检测各批次妊娠母猪的IgG和IgA抗体的阳性率，分析离散度，为防控该疫病提供重要依据。1材料与方法1.1病料来源采集2021年112月阿克苏地区某规模化猪养殖场不同场区腹泻猪肛拭子，放入-20
10、 冰箱保存。1.2试剂病毒DNA/RNA纯化试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；猪腹泻胶体金检测试剂盒购自北京金诺百特科技有限公司（批号：BE201104）；猪流行性腹泻病毒荧光定量 PCR 检测试剂盒购自湖南冠牧生物科技有限公司（批号：2021002，2021003，2021004，2021005，2021006，2021008）；TGE-PED（WH-1株+AJ1102株）二联弱毒苗，TGE-PED（WH-1株+AJ1102株）二联灭活苗，均购自武汉科前生物股份有限公司；猪流行性腹泻IgG抗体检测试剂盒购自加拿大Biovet生物技术有限公司（批号：203024）；猪流行性腹泻IgA抗体检
11、测试剂盒购自爱德士生物科技有限公司（批号：21093）。1.3仪器仪器见表1。表1主要仪器主要仪器多管架自动平衡离心机自动洗板机实时荧光定量PCR仪电热恒温培养箱型号TDZ5-WSHBS-4009Quant Studio Q5DHP-9082厂家湖南湘仪实验室仪器开发有限公司南京德铁实验设备有限公司美国ABI公司产品上海一恒科技有限公司ber 2021.The infection status of PEDV in different months was detected using real-time fluorescence quantitative method.To preventa
12、nd control PED,a combination of TGE-PED attenuated vaccine and inactivated vaccine was used to immunize 85 and 105 day preg-nant sows.Indirect ELISA was used to monitor IgG and IgA antibodies in pregnant sows,and the immune efficacy of the pig epidem-ic diarrhea virus vaccine in the farm was evaluat
13、ed.The results showed that the detection rate of PEDV was higher in January,Febru-ary,November and December,while it was lower in other months.The positive rates of IgG and IgAantibodies against PEDV in preg-nant sows reached 100%on the 15th day before delivery and on the day of delivery,with a disp
14、ersion of less than 40%.The immuneeffect was good.On the day before delivery,the IgG antibody positive rate of each batch of PEDV still reached 100%,but the IgA an-tibody positive rate decreased to varying degrees,and the dispersion increased to varying degrees,indicating that there may be detoxi-fi
15、cation in sows.This study provides a theoretical basis for the prevention and control of PED in the pig farm.Keywordsporcine epidemic diarrhea;quantitative PCR;PEDV;immune antibody邢潇月 等：阿克苏地区某规模化猪场猪流行性腹泻的诊断和疫苗效果评价61塔里木大学学报第35卷1.4猪流行性腹泻的胶体金检测阿克苏某规模化猪场猪腹泻病发病当天，随机取猪腹泻物，按照PEDV胶体金试剂盒操作步骤进行PEDV检测，等待5 min。
16、1.5猪流行性腹泻的实时荧光定量检测严格按照病毒DNA/RNA纯化试剂盒的操作说明提取6 567份（五混一处理，阳性进行单检）猪肛拭子中的总RNA。以所得总 RNA 为模板进行 qPCR 扩增，反应体系为 PEDV-反应液 19 L，PEDV-酶混合液 1 L，PEDV-内标0.5 L，模板5 L。反应条件为预反应，50，2 min；Taq酶活化，95，5 min；变性，95，15 s，退火，延伸，荧光采集，60，30 s，40个循环；仪器冷却，25，10 s。1.6猪流行性腹泻的抗体检测选用TGE-PED二联弱毒苗和灭活苗分别在母猪妊娠85 d和妊娠105 d时进行免疫，并在产前15 d、产前 1 d 及分娩当天采取各批次（0225、0325、0408、0520、0617、0715、0812、0909、1007、1104、1202）妊娠母猪血样及分娩当天初乳，全血5 000 r/min离心10min，抽取血清，严格按照猪流行性腹泻IgG抗体检测试剂盒与猪流行性腹泻IgA抗体检测试剂盒的说明书进行检测。检测结果标准判定如下：1）对照：NCx=NC1 A(650)+NC2 A(650)/