1、Provincefrom2021to2022LJJ:AnimalHusbandry&VeterinaryNMedicine,2023,55(6):87-92.JIANGDD,WANGK Y,DU YJ,et al.Molecular epidemiological investigation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection in Shandong2022年山东省猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查J.畜牧与兽医，2 0 2 3，55（6）：8 7-92.姜丹丹，王凯月，杜以军，等。2 0 2 1
2、-.87:2023年畜牧与兽医第6 期第55卷2021一2 0 2 2 年山东省猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查姜丹丹，王凯月2.3，杜以军，姜平1*（1.南京农业大学动物医学院/农业农村部动物细菌学重点实验室，江苏南京210095；2.山东省农业科学院畜牧兽医研究所/山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室，山东济南2 50 10 0；3.天津农学院动物科学与动物医学学院，天津30 0 38 0）摘要：为研究2 0 2 1一2 0 2 2 年猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）在山东地区的流行情况，从疑似发病的猪场采集了10 3份临床样本，采用RT-PCR方法对样品进行检测，并对阳性样品进行
3、GP5和NSP2基因的序列测定、遗传进化分析以及同源性分析。结果显示：10 3份样品中检测到2 1份阳性样品，阳性率为2 0.38%。最终有5个样品能够同时扩增出GP5和NSP2基因序列，遗传进化分析显示，这5个样品中有2 个属于谱系（l i n e a g e）1；2 个属于lineage5；1个属于lineage8。各样品之间GP5基因的核苷酸同源性为8 1.5%99.3%，NSP2基因的核苷酸同源性为56.9%99.4%。本研究表明2 0 2 1一2 0 2 2 年山东地区的PRRSV传播呈现多样性，为PRRSV毒株的遗传变异、演化分析和防控提供了理论基础。关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒
4、；同源性；流行病学；遗传变异；进化分析中图分类号：S852.6文献标志码：A文章编号：0 52 9-5130(2 0 2 3)0 6-0 0 8 7-0 6Molecular epidemiological investigation of porcine reproductive and respiratorysyndrome virus infection in Shandong Province from 2021 to 2022JIANG Dandan,WANG Kaiyue23,DU Yijun”,JIANG Ping1*(1.Key Laboratory of Bacteriolo
5、gy,Ministry of Agriculture and Rural Affairs/College of Veterinary Medicine,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China;2.Institute of Animal Science and Veterinary Medicine,Shandong Academy of Agricultural Sciences/Shandong Province Key Laboratory of Animal Disease Control and Breeding,Jin
6、an 250100,China;3.College of Animal Science and Veterinary Medicine,Tianjin Agricultural University,Tianjin 300380,China)Abstract:To study the prevalence of porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV)in Shandong Province from 2021 to2022,103 clinical samples were collected of the susp
7、ected disease afflicting pigs in different farms.RT-PCR was used to detect the presenceof PRRSV in the samples.The results showed that 21 samples were positive,at a positive rate of 20.38%.Then,the GP5 and NSP2 genes of5 PRRSV strains were amplified and sequenced at the same time.The genetic evoluti
8、on analysis showed that two strains belonged to lineage1,another two strains belonged to lineage 5 and one strain belonged to lineage 8.The nucleotide homology of the CP5 and NSP2 genes of the5 PRRSV strains were 81.5%-99.3%and 56.9%-99.4%,respectively.Our study showed that PRRSV transmission in Sha
9、ndong Provincefrom 2021 to 2022 was of diversity,which provided a theoretical basis for the genetic variation,evolutionary analysis,and prevention andcontrol of PRRSV.Keywords:PRRSV;homology;epidemiology;genetic variation;evolutionary analysis猪繁殖与呼吸综合征E（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种危害全球养猪业发展的接触性传染病
10、。PRRSV属于动脉炎病毒收稿日期：2 0 2 3-0 3-0 6；修回日期：2 0 2 3-0 4-10基金项目：山东省自然科学基金（ZR2020QC196，ZR2 0 2 0 K C0 0 5，ZR2021MC139,ZR2021ZD08）；国家自然科学基金（32 10 2 7 10）第一作者：姜丹丹，女，博士研究生*通信作者：姜平，教授，主要从事动物传染病学研究，E-mail：。科动脉炎病毒属成员，其基因组全长为15.4kb，是一种有囊膜的单股正链RNA病毒 1-3。PRRSV分为美洲型和欧洲型2 个基因型，每个基因型又分为多个基因亚型 4。1996 年我国首次分离到PRRSV，并将其命
11、名为CH-la；2 0 0 6 年后出现高致病性PRRSV（H P-PRRSV），其特征是NSP2基因出现了30 个氨基酸的不连续缺失，猪体感染后出现高热、高发病率和高死亡率的明显特性 4-6 。2 0 15年以来，出现NADC30毒株流行 7-8 。为了解2 0 2 12 0 2 2 年山东地.88Animal Husbandry&VeterinaryMedicine2023No.6Vol.55区PRRSV的流行情况和变异趋势，本试验对2 0 2 1年1月到2 0 2 2 年11月采集的山东地区10 3份PRRSV临床疑似样品进行PCR检测和GP5和NSP2基因测序，并分析其遗传进化规律，为
12、PRRS的防控提供理论依据。1材料与方法1.1主要试剂DNA Marker DL5000、D NA M a r k e r D L2 0 0 0、Pr i-meScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(PerfectReal Time）、Pr i me ST A R H S D NA Po l y me r a s e 等购自TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司；DNA回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；pEASY-Blunt Cloning Kit 购自Transgen Biotech 公司。1.2病料来源与处理2021年1月到2 0 2 2
13、 年11月，在山东省多家养殖场采集10 3份疑似PRRSV感染的样品，包括脾脏、淋巴结和肺脏等。称取1g的病料样品，放入2 mL离心管中剪碎，向管中加人1mL的灭菌PBS后使用组织研磨仪充分研磨，将研磨液放入-8 0 冰箱中反复冻融3次，12 0 0 0 r/min离心15min，上清液经0.22m滤器过滤后置于-8 0 冰箱中保存。1.3引物设计与合成参考GenBank上收录的PRRSVGP5和NSP2基因序列，在基因上、下游的保守区设计引物CP5-F：5-GGGCGACCGTTTTAGCCTGTCT-3，G P5-R:5-ATGGAAAACGCCAAAAGCACCTT-3和 NSP2-F:
14、5-TGATTGGGATGTTGTGCT-3，NSP2-R:5-ATGATGGCTTGAGCTGAG3。PRRSV N基因的引物参考文献9。引物由北京擎科生物科技有限公司合成。1.4RT-PCR扩增及基因测序使用TRIzol法提取病料样品中的RNA，用Pri-meScriptTMRT reagent Kit withgDNA Eraser反转录试剂盒对其进行反转录，得到cDNA。以反转录得到的cDNA为模板，GP5-F/R和NSP2-F/R分别为引物，进行PCR扩增，反应体系如下：GP5-F/CP5-R或NSP2-F/NSP2-R上、下游引物（浓度为10 mol/L)各1 L，5 Pr i m
15、e ST A R Bu f f e r（M g Pl u s）10 L,10 x dNTP Mixture（2.5 m m o l/L e a c h）4 L，c D NA100 ng,PrimeSTAR HS DNA Polymerase 1.5 L,加ddH,0至总体积为50 L。将体系配好后，混匀并瞬离，置于PCR仪中进行扩增反应，反应条件如下：982 m in;9 8 30 s，,58 30 s,7 2 1.5m in,35个循环；7 2 10 min；4保存。PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，阳性样品使用DNA回收试剂盒进行胶回收后，连接到pEASY-Blunt载体，并转化到
16、DH5感受态中，送北京擎科生物科技有限公司测序1.5PRRSV遗传进化分析使用DNAStar、M EG A 7.0 软件分析测序片段与GenBank中收录的2 0 株PRRSV毒株（表1）GP5和NSP2基因的同源性，构建遗传进化树，分析2 0 2 1一2022年山东地区PRRSV的遗传变异特征。表1参考毒株信息病毒名称地区年份登录号谱系HUB1中国2006EF0759458BJ中国2016EU8257238HUN4中国2006EF6350068TJ中国2006EU8602488JXA1P80中国2008FJ5488538JXA1中国2006EF1124458JXwn06中国2016EF6410088GDBY1中国2008GQ3744428CH-1a中国1996AY0326268CH-1R中国2008EU8078408GD中国2008EU8257248CM2中国2011JN6624243QYYZ中国2011JQ3087983QY2010中国2010JQ7436663MN184B美国2006DQ1760201CHsx1401中国2014KP8616251JL580中国2015KR7063