1、第 9 卷 第 3 期2023 年 6 月生物化工Biological Chemical EngineeringVol.9 No.3Jun.2023文章编号：2096-0387（2023）03-06CRISPR/dCas9 系统的研究进展和应用刘雅睿（中国海洋大学 海洋生命学院，山东青岛 266003）摘 要：基于 RNA 指导的 CRISPR/Cas9 系统是目前分子生物学研究中最有效和成本最低的工具之一。若 Cas9 蛋白的 HNH、RuvC 结构域失活，就会形成失去剪切 DNA 能力的 dCas9 蛋白。与其他基因组调控技术相比，CRISPR/dCas9 的主要优势在于其直接性、目标特异
2、性、适应性和可逆性。本文介绍了 CRISPR/dCas9 的作用机制，总结了近年来 CRISPR/dCas9 在基因组调控（CRISPRi和 CRISPRa）和表观遗传学修饰（DNA 与组蛋白修饰）领域的研究进展及其在基因组成像、植物研究及癌症治疗方面的实际应用，对其未来可能的发展方向进行了展望，为 CRISPR/dCas9 进一步的研究提供参考。关键词：CRISPR/dCas9；基因组调控；表观遗传学；基因组成像中图分类号：Q78；Q756 文献标识码：CResearchProgressandApplicationofCRISPR/dCas9SystemLIU Yarui(College o
3、f Marine Life Sciences,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)Abstract:The RNA-guided CRISPR/Cas9 system is one of the most efficient and least costly tools for molecular biology research nowadays.If the HNH and RuvC domains of Cas9 proteins are inactivated,dCas9 proteins with the deficiency
4、 of cleaving DNA ability are formed.The main advantages of CRISPR/dCas9 over other genomic regulatory technologies are its directness,target specificity,adaptability and reversibility.This review introduces the mechanism of CRISPR/dCas9,summarizes the recent research progress of CRISPR/dCas9 in geno
5、me regulation(CRISPRi and CRISPRa)and epigenetic modification(DNA and histone modification),as well as its practical applications in genomic imaging,plant research and cancer therapy.The possible improvement of CRISPR/dCas9 in the future is prospected,which provides a reference for further research
6、of CRISPR/dCas9.Keywords:CRISPR/dCas9;genome regulation;epigenetics;genomic imaging 基因编辑是研究基因功能的重要方法之一，目前研究人员大多使用人工核酸内切酶（Engineered Endonuclease，EEN）进行基因编辑，常见的 EEN包 括 锌 指 核 酸 内 切 酶（Zinc Finger Endonuclease，ZFN）、类转录激活因子效应物核酸酶（Transcription Activator-Like Effector Nuclease，TALEN）以及 CRISPR/Cas（Clustere
7、d Regulatory Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR associated proteins）系统1。基于蛋白质-DNA 识别的 ZFN、TALEN 定位新位点时需要设计复杂的蛋白质，因此很难应用于高通量技术。与其相比，基于 sgRNA 指导的 CRISPR/Cas 系统具有多样性、模块化、高效率的特点，且易于设计合成，是基因组编辑及基因表达调控方面的理想工具。CRISPR/Cas9 系统是存在于许多细菌和大部分古菌中的适应性免疫系统，可以抵御病毒、质粒等外源遗传物质入侵细胞2。CRISPR 系统由多样的 Cas9蛋白和引导 RNA
8、（guide RNA，gRNA）组成。引导RNA 包含两部分，分别是成熟的 crRNA（CRISPR RNA）和 tracrRNA（trans-activating RNA）。当外源遗传物质（如 DNA）入侵生物体时，个体的 CRISPR 系统会以外源 DNA 的原间隔序列邻近基序（Protospacer Adjacent Motif，PAM）序列为靶点，捕获切割 PAM 邻近的外源 DNA，并将其作为间隔序列整合到 CRISPR的两个重复序列之间，转录后得到 pre-crRNA，再经作者简介：刘雅睿（1999），女，河北廊坊人，本科，研究方向为基因编辑。刘雅睿：CRISPR/dCas9系统的
9、研究进展和应用第 3 期157过剪切得到的成熟的 crRNA，与 tracrRNA 形成双链gRNA 结 构。gRNA 与 Cas9 蛋 白 组 成 具 有 DNA 内切酶活性的复合物，在 gRNA 的引导下与外源 DNA特异性结合，并使用 Cas9 蛋白的核酸结构域对外源DNA 进行切割。不同生物体内的 CRISPR 系统有所不同，可以大致分为 I 型、型、型三类。其中酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）的型 CRISPR 系统由成熟 的 crRNA、tracrRNA 构 成 的 sgRNA（single guide RNA）及 Cas9 蛋白组成。Cas9-sgRNA
10、 复合物与目标DNA 结合后，Cas9 蛋白的 HNH、RuvC 结构域分别切割与 gRNA 互补的 DNA 目标链和非目标链，导致双链断裂。如果 Cas9 蛋白的 HNH 结构域第 840 位由组氨酸突变为丙氨酸，且 RuvC 结构域第 10 位由天冬氨酸突变为丙氨酸，这两个核酸酶结构域就会处于失活状态，失去剪切 DNA 的能力，通常把这种核酸酶失活的 Cas9 蛋白称为 dCas9（deficient Cas9）蛋白。dCas9 虽然失去了剪切 DNA 的能力，但依然能在sgRNA 的引导下与 DNA 特异性结合，因此可以用于基因组转录调控、表观遗传学修饰、活细胞成像等领域3。本文根据已有
11、报道，总结了 CRISPR/dCas9 系统在不同领域的研究进展及应用现状，并对其未来的研究进行展望。1 dCas9 对基因组转录的调控dCas9 是依赖 RNA 的 DNA 结合蛋白，可以不改变目标基因序列，直接对目标基因转录进行修饰及调控。将 dCas9 与不同效应物融合进行工程化改造，便可以实现序列特异性基因组调控。典型应用就是CRISPRi（CRISPR interference）和 CRISPRa（CRISPR activation）。CRISPRi 意为 CRISPR 干扰技术，可以干扰 RNA的转录。在以细菌为代表的原核生物中，dCas9可以通过空间位阻单独阻断 RNA 聚合酶（
12、RNA Polymerase，RNAP）的转录延伸，从而阻断转录。QI等4 的研究表明，CRISPRi的沉默效应可以被诱导和逆转，且通过全转录组鸟枪法测序发现 CRISPRi sgRNA 引导的基因沉默具有高度特异性，没有显著的脱靶效应。而在真核生物中，单一 dCas9 的 CRISPRi 抑制转录效率较低，为了提高 CRISPRi 效果，可以将 dCas9 与抑制转录的复合物结合来沉默基因表达。如 GILBERT等5将 dCas9 和抑制转录的 Krppel 相关框（KRAB）结构域融合，可以有效抑制人类细胞转录。CRISPRa 即 通 过 CRISPR 系 统 激 活 或 增 强 转录。B
13、IKARD 等6将 RNAP 的 亚基融合到 dCas9的 C 端，这个复合物可以定向到启动子区域，有效募集 RNAP 以激活基因表达。此外，dCas9 还可以与哺乳动物细胞中的 VP64、p65AD 等转录激活因子相结合，激活基因表达。为了提高 CRISPRa 的效率，可以同时招募多种转录激活因子来上调基因转录，常见的有协同激活诱导因子（Synergistic Activation Mediator，SAM）、SunTag、VPR（VP64-p65-Rta）系统。（1）KONERMANN 等7设计的 SAM 系统以 sgRNA和 dCas9 为支架募集多种协同作用激活因子，在该系统中，dCa
14、s9-VP64 与含有两个 MS2 RNA 的 sgRNA结合，形成的 MS2-VP64 可以招募同源蛋白 MCP，形成 MCP-p65-HSF1 激活结构域。（2）SunTag 是一种重复多肽支架，与 dCas9 结合后，抗 GCN4 可以招募多个转录激活因子放大基因表达信号。如 LIU 等8使用 dCas9-SunTag-VP64 激活内源性 Oct4 和 Sox2，触发细胞重编程，诱导产生多功能干细胞。（3）VPR 系统则是将VP64-p65-Rta串联融合后与dCas9连接，形成三方激活域。CHAVEZ 等9的实验发现 dCas9-VPR 对内源基因的激活能力远高于 dCas9-VP6
15、4（22 320 倍），且 VPR 可通过多基因靶向激活多位点，提高整个基因组的表达水平。除了可以将单个 dCas9 蛋白与转录抑制或激活因子融合，调节某个特异性基因的转录之外，还可以通过支架 RNA（scaffold RNA，scRNA）来对同一细胞内的不同基因进行多模式调控。ZALATAN 等10将 CRISPR/dCas9 的 sgRNA 与 RNA 适配体相融合，构建 scRNA。RNA 适配体可以招募与激活因子或阻遏物融合的 RNA 结合蛋白调控转录，通过在每个scRNA 上设计多个 RNA 募集位点，便可以独立调整每个靶位点的激活或抑制强度，能同时调节多个基因的转录表达。2 dCa
16、s9 的表观遗传学修饰表观遗传是指 DNA 序列改变之外基因组功能表达发生的可遗传变化，其中以 DNA 与组蛋白修饰为代表的染色质编辑是表观遗传学领域的重要部分。dCas9 可以用类似调控靶向基因转录的方式，招募表158生物化工2023 年观遗传修饰域来改变其靶向 DNA 位点的表观遗传标记，从而导致相关基因表达的变化。（1）DNA 甲基化是重要的表观遗传标记之一，其甲基化活性对目标区域具有特异性，并且可以在有丝分裂中遗传。VOJTA 等11将 dCas9 与 DNA 甲基转移酶 DNMT3A 结合，其融合蛋白能在以 PAM 序列下游 27 bp 为中心，约 35 bp 宽的区域中靶向 CpG 甲基化，且多个 gRNA 可以将 dCas9-DNMT3A 复合物靶向多个相邻位点，使启动子甲基化水平升高，从而沉默基因表达。（2）而在 DNA 去甲基化方面，Tet双加氧酶的催化结构域可以氧化甲基形成 5-羟甲基胞嘧啶，然后通过 DNA 糖基化酶将其恢复为未修饰胞嘧啶来实现去主动甲基化。如 LIU 等12构建了dCas9-Tet1 融合蛋白在分裂细胞中有效靶向去甲基化，激活基因表达；XU 等1