1、：综述 系统在 检测中的应用周建，詹远长，王馨，徐璞，张娜，李卓（西安医学院第一附属医院检验科，西安；西安航天总医院医学检验科，西安）摘要：新型冠状病毒（）全球流行，快速有效的检测方法对于疫情防控和患者救治极为重要。目前已有多种方法应用于 的检测，但均存在一定的局限性。研究发现，采用 系统构建的 检测方法具有快速、便捷的优势。目前应用于 检测的 系统主要包括 、和 ，多以 的核酸和蛋白质作为检测靶标。因此，该文对基于 系统的 检测方法分别从核酸和蛋白质 个角度进行综述，并就各自的优缺点及未来发展趋势进行分析，期望为 系统在传染病检测中的应用提供参考。关键词：系统；检测中图分类号：文献标志码：新
2、型冠状病毒（，）的流行已对全球 多个国家和地区的医疗健康和经济造成严重影响，快速、有效的检测方法是防止 病 毒 扩 散 和 阻 断 患 者 感 染 的 基 本 手 段。针 对现已建立了多种检测方法，包括抗原、抗体和核酸检测，其中抗原和抗体检测存在特异性和敏感性较差等问题，核酸检测虽被认为是 检测的金标准，但传统的核酸检测方法中实时荧光定量（）耗时长，且对人员和实验室均有严格的准入要求，因此越来越多的研究者试图开发操作简单、价格便宜、敏感性和特异性较高的 检测方法。研究发现，成簇规律间隔短回文重复序列及其相关基因和 蛋白（，）系统可用于核酸检测，且因其具有简单、快捷等优势，更适用于医疗水平欠发达
3、地区的 检测。基于 系统的优势，目前已陆续建立了针对 核酸和蛋白质水平的检测系统，极大的丰富了实验室检测方法的多样性。本文针对基于 系统的 检测方法作一综述，期望为开发更有效的传染病检测方法提供依据。新型冠状病毒 的命名源自世界卫生组织（，），属于 目，冠状病毒科和冠状病毒亚科，含有（）、（）、（）和（）个属。含有包膜，属于 冠状病毒属的正链单链 病毒。其基因组长度约为，结构基因含有开放阅 读 框 （，），分 别 为 和，。病毒颗粒含有核衣壳蛋白（，）、刺突蛋白（，）、包膜蛋白（，）和膜蛋白（，）等主要结构蛋白。其中 蛋白的受体结合区域（，）与宿主细胞表面血管紧张素转化酶（，）结合，感染宿主。
4、目前对 的核酸检测，主要针对、和 设计靶向区域。应用于 检测的 系统类型 是细菌和古生菌的天然免疫系统。系统在引导（，）的作用下识别和切割靶向核酸序列，现已被广泛应用于基因编辑、核酸检测及转录调控等方面。目前自然界中已发现两大类 系统：和 ，主要包括 、共 种类型。应用于 检测的主要包括、和 （图）。其中，在 引导下 蛋白对目标 序列识别和切割；在 的引导下识别靶向核酸序列，激活 的靶向和非靶向切割活性，；在 的引导下识别和切割靶向单链（，），同时激活 的非靶向切割（）功能。临床检验杂志 年 月第 卷第 期 ，基金项目：陕西省卫生健康委联合攻关项目（类）（）；西安市科技局（西安市创新能力强基计
5、划医学研究项目）（）；西安医学院校级科技创新团队项目（）。作者简介：周建，年生，男，副主任技师，博士，主要从事分子诊断研究。通信作者：李卓，教授，博士，：。注：，；，；，。图 应用于 检测的 系统类型 基于 系统的 检测技术 基于 的 核酸检测技术 基于无酶切活性的 蛋白（，）的 核酸检测技术其是 联合生物素与链霉亲和素过氧化物酶构建的检测系统。检测过程如下：首先将 固定在固定相载体上，然后将针对 的 和 基因设计的靶向 和用生物素标记的识别前间区邻近序列（，）递呈寡核苷酸（）加入检测体系，当检测系统中存在 的靶向序列时，复合体识别靶向序列与 识别序列形成复合体。标记有生物素的 与 识别靶向序
6、列形成复合物，然后生物素与链霉亲和素过氧化物酶结合，与氧化四甲基联苯胺反应产生颜色变化，通过颜色反应即可检测 靶标的存在。该检测系统能够有效地将核酸靶标通过 转化为传统酶联免疫检测过程，可实现 孔的高通量检测能力。基于无切割活性的（，）构建的 核酸检测平台该平台是一种用 和生物素标记技术构建的侧向流试纸条技术。其检测基本过程为：首先通过生物素和荧光（，）分别标记上、下游引物，然后通过逆转录重组酶扩增技术（，）扩增目标区域。在 的引导下，靶向识别目标序列，形成含有生物素和 标记的复合体，应用侧向流试纸条检测信号。检测系统利用 的靶向识别能力转化核酸靶标信号为侧向流试纸条信号，实现了可视化读取信号
7、，并可实现传染性疾病的核酸快速检测。基于 编辑器链接的同质化（，）的 检测平台该平台主要应用 联合 技术构建。酶具有高特异性识别靶向碱基的特点，其检测的基本过程为：首先采用生物素标记 引物，扩增目标区域，识别靶向区域序列进行 核酸检测，时间约需 。系统的 酶识别靶向序列具有高度特异性，可实现单个碱基区分，因此在未来传染性疾病的病原分型鉴定方面具有一定优势。可介导侧向流核酸检测（，）平台该平台主要采用 联合侧向流试纸条检测技术构建。通过地高辛（）和生物素标记的 引物，采用侧向流试纸条检测 靶标。检测系统针对 和 基因设计 扩增引物，分别用 和生物素标记重组酶等温扩增（，）上、下游引物，采用三线侧
8、向流动（，）读取检测结果，其阴性符合率高达，阳性符合率为，曲线下面积（）为 。检测平台 是 采 用 技 术 联 合 构 建 的核酸检测平台，该系统能有效防止实验室扩增产物气溶胶的污染引起的假阳性结果。综上所述，基于 建立的 核酸检测系统，利用 系统的靶向识别和切割能力，通过核酸检测与侧向流技术及荧光信号技术的有机结合，实现了肉眼读取检测结果，具有简便快捷、特异性高等优势。但同样也存在一定局限性：其一，系统本身具有脱靶效应，可能产生假阳性结果；其二，核酸检测系统为了提高检测的灵敏度，均需联合等温扩增技术对靶向区域进行扩增，增加了操作步骤，也加大了污染机会；其三，核酸检测系统前期需要复杂的生物信息
9、设计，增加了应用难度。基于 的 检测技术 基于荧光读取信号的 的 核酸检测技术基于 内切酶靶向 反式报告基因（，）的 核酸检测系统该系统是 联合和逆转录环介导等温扩增（，）技术构建的平台，该技术针对 的 和 基因设计引物和，在 的引导下识别靶向序列后，激活 非特异性切割双荧光标记单链临床检验杂志 年 月第 卷第 期 ，（，），产生荧光信号，检测时间 。另 一 种 基 于 一 步 法 内 切 酶 靶 向 反式报告基因（，）核酸检测平台，是采用 和逆转录重组酶等温扩增（，）技术构建的 核酸一步法检测平台，其检测限为 ，该系统可通过一步法完成检测，大幅缩短了检测流程，可有效避免检测过程中的污染机会。
10、基于冻干 的（，）的核酸检测平台该平台采用 联合 技术构建，可以通过读取荧光信号检测 核酸。无 须 纯 化 的 环 介 导 等 温 扩 增 联 合（，）核酸检测平台是一种不需要核酸提取的 核酸检测方法，联合 检测 病毒的 基因，非靶向切割荧光标记的 产 生 荧 光 信 号，比 色 法 读 取 荧 光 信 号。检测平台无须核酸提取过程，减少了操作流程，也减少了污染机会。基于 链接的解锁反应（，）的 核酸 检 测 平 台 该 平 台 是 一 种 联 合构建的检测方法，具有检测时间短、设备简单等特点，提高了检测效率。基于 的增强（）核酸检测平台该平台采用 联合 或 技术构建，体外扩增 ，非靶向切割荧
11、光标记的 产生荧光信号，通过荧光酶标仪或侧向流动试纸条读取检测结果，该平台可以实现 的现场检测。基于体外特异性（，）的 核酸检测平台该平台依赖于 联合 技术构建，非靶向切割荧光素标记的 产生荧光信号，侧向流动试纸条读取结果，检测时长。综上所述，基于荧光读取信号的 的 核酸检测技术是利用 蛋白的非靶向切割 能力，采用双荧光标记 序列，非特异性切割双荧光标记 序列产生荧光信号。该平台具有信号读取方便，耗时短等优势，尤其是基于侧向流动试纸条读取结果的检测系统，读取方式简单，操作简便，对人员要求低，可实现居家检测。可视化的 的 核酸检测技术基于 单管等温放大与可视化（，）的 核酸检测平台该平台针对 的
12、、和 基因为靶标，反应 、扩增靶标区域，切割荧光标记的非靶向核酸序列，紫外灯检测信号，约需，特异性为。基于一步法 联合逆转录环介导的等温可视化（，）的 核酸检测平台 该 平 台 是 联 合，等温扩增 ，靶向识别 的 基因，激活非靶向切割荧光标记，蓝光下肉眼读取信号，实现可视化读取结果。基于 的肉眼可见的可视化读取的（，）核酸检测平台该平台通过 扩 增、基 因，非靶向切割荧光标记 序列，产生荧光信号，肉眼读取荧光信号，检测下限为 ，约需 。基于 灯光的 相关的（，）核酸可视化检测平台 识别靶向序列后，激活其非靶向切割 产生荧光信号，灯下 、读取信号，具有信号读取方便等优势。基于 一步法（，）的可
13、视化 检测平台该平台通过一步法即可完成 的检测，用时 ，减少了操作步骤，也降低了污染机会。基于（，）的可视化 核酸检测技术该技术中 通过光密度可视化读取荧光信号，极大提高了检测灵敏度，一步法即可完成检测操作。综上所述，通过 系统建立的可视化信号读取方法极大地提高了 核酸检测的可操作性，通过 将 的核酸信号转化为可视化的荧光信号，有望实现传染性疾病核酸检测的居家自测目的，因此其在未来的核酸检测过程中具有巨大潜力。其他基于 的 核酸检测系统 基于便携式血糖仪的 （，）系统的 核酸检测方法、和非特异性 标记有蔗糖酶转化酶（）和磁珠（，），扩增靶向序列，在 的引导下采用 识别靶向序列激活其切割蔗糖酶转
14、化酶和 标记的非靶向，获得自由的蔗糖酶转化酶，反应液中蔗糖转化为葡萄糖，通过检测反应液中的葡萄糖间接获取靶标 核酸。基于 联合 大片段诱导的早孕试纸条信号开发的（，）核酸检测方法 其是由 联合商品化的早孕试纸条构临床检验杂志 年 月第 卷第 期 ，建，主要由 和菜花状的大片段 组合体（，）以及 和人绒毛膜促性腺激素结合 探针（，）等元件构成。扩增靶向区域，非靶向序列为 标记，引导 切割靶向序列后非靶向切割 序列，获得游离的 与试纸条结合显色。而当体系中不存在靶向序列时，序列不能被切割，无法获得游离，阻碍其与早孕试纸底物结合，因此不显色。系统联合早孕试纸条技术提供了一种新的 核酸检测方法，便于推
15、广应用。基于 等速增强电泳（，）的 检测技术该技术是采用 系统联合微流体芯片技术开发的，应用微流体芯片等速电泳（，）的选择性离子聚焦技术在微流体芯片产生优化的电场梯度，系统依赖微流体芯片的等速电泳提取病毒 约需 ，靶向基因扩增约 ，然后依赖微流体芯片联合 系统 完成检测，内可检测出样本中的核酸含量。基于（，）的 核酸检测技术主要通过 、联合微流控芯片（）技术进行 核酸检测，识别目标序列后激活非靶向荧光标记的 序列，应用微流控芯片读取检测信号，检测过程约需 。基于 的 的 蛋白检测技术一种基于 衍生的电化学传感器能够快速、高效、灵敏地检测 病毒核衣壳蛋白（）。其首先将亚甲蓝标记的聚腺嘌呤 序列（
16、电化学报告基因）固定在金电极表面，然后制备核酸适配体弓形探针，当有 病毒存在时，病毒的核衣壳蛋白与适配体之间相互作用，激活 链从适配体探针释放（激活链为 识别的靶向 序列），然后激活 非靶向切割活性，即切割电极表面的 分子产生电位变化，其检测 的检测限（，）低至 ，在 内完成检测。该检测系统对其他蛋白质表现出很高的选择性，因此在 的早期诊断、环境监测、食品安全等方面具有巨大潜力。综上所述，基于 构建的 检测系统主要有 和 ，其识别的靶向序列有 和蛋白质，然而 为 病毒，因此检测过程中首先需要逆转录 为 序列，然后对靶标区域进行体外扩增，增加 识别的底物浓度和检测灵敏度，但是也相应增加了操作步骤。大部分基于 的 检测系统识别的靶标区域为 的、和 基 因。联合芯片检测 核酸能够极大地提高检测灵敏度，但是也增加了检测成本。利用 建立的一步法 核酸检测系统，有效减少了操作步骤，也降低了污染机会，但是一步法中 识别并切割靶向序列作为体外核酸扩增的模板，同时非特异性切割等温扩增引物序列，抑制体外扩增的效率，两步法策略虽避免了这一问题，但是却增加了污染可能，这也是 检测系统在未来研究中亟待解决的问题