1、282DOl:10.12300/j.issn.1674-5817.2022.166Mical12a基因表达下调抑制斑马鱼血管发育杨晋娴1 2，王淑娟，翟金云，朱顺星12(1.南通大学杏林学院，南通2 2 6 0 0 1；2.南通大学实验动物中心，南通2 2 6 0 0 1)摘要】目的探究斑马鱼胚胎早期发育过程中Micall2a基因的表达模式，以及该基因对斑马鱼血管发育的影响。方法使用Tg（f l i:G FP）转基因斑马鱼（用绿色荧光蛋白标记血管）和野生型斑马鱼（AB），采用全胚胎原位杂交技术检测其早期胚胎不同发育阶段的Mical2a基因表达水平。通过显微注射吗啉反义寡核苷酸下调Micall2
2、a基因，并采用实时荧光定量PCR技术检测该基因在斑马鱼胚胎不同发育阶段mRNA表达水平。采用激光共聚焦显微成像技术，观察并分析Mical/2a基因下调后斑马鱼的血管表型变化。结果受精后2 4h（2 4 h o u r s p o s t-f e r t i l i z a t i o n，24hpf)、36 h p f 和48 hpf的斑马鱼早期胚胎的脑、心脏、血管系统中均有Mical2a基因表达。显微注射吗啉反义寡核苷酸后Micall2a基因的mRNA水平增加，抑制斑马鱼胚胎的血管发育，导致斑马鱼节间血管发育缺陷。结论Micall2a基因表达下调可以抑制斑马鱼血管的发育。【关键词】Mical
3、l2a基因；原位杂交；胚胎发育；血管发育；斑马鱼；血管依赖性疾病中图分类号】R-332；Q 95-33文献标志码】A【文章编号 16 7 4-58 17(2 0 2 3)0 3-0 2 8 2-0 6Downregulation of Micall2a Gene Expression Inhibited VascularDevelopmentin ZebrafishYANG Jinxian2,WANG Shujuan,ZHAI Jinyun,ZHU Shunxingl?(1.Xinglin College of Nantong University,Nantong 226001,China;2
4、.Laboratory Animal Center of NantongUniversity,Nantong 226001,China)Correspondence to:ZHU Shunxing(ORCID:0000-0001-8011-4099),E-mail:ABSTRACT Objective To explore the expression pattern of Micall2a gene during the early developmentof zebrafish embryos and the effect of this gene on zebrafish vascula
5、r development.Methods Wholeembryo in situ hybridization was used to detect Micall2a expression levels at different stages of earlyembryo development of Tg(fli:GFP)transgenic(labeled with green fluorescent protein)and wild typezebrafish(AB).Micall2a gene expression was downregulated by microinjection
6、 of a morpholine antisenseoligonucleotide,and real-time fluorescent quantitative PCR was used to detect mRNA expression of thegene at different developmental stages of zebrafish embryos.Laser confocal microscopy was used toobserve and analyze vascular phenotypic changes in zebrafish after the downre
7、gulation of Micall2a.Results Micall2a was expressed in the brain,heart,and vascular system of zebrafish embryos at the24th,36th,and 48th hours post fertilization.The mRNA level of Micall2a increased after microinjectionof morpholine antisense oligonucleotides,inhibiting vascular development in zebra
8、fish embryos,resulting in internode angiogenesis defects in zebrafish.Conclusion Downregulation of Micall2aexpression inhibits the development of blood vessels in zebrafish.Key words Micall2a gene;In situ hybridization;Vascular development;Embryonic development;Mical（mo l e c u l e i n t e r a c t i
9、 n g w i t h Ca s L）是一类细胞质内多结构域蛋白的保守家族，与细胞的轴突引导和运动、细胞连接的形成、囊泡的转运，以及癌细胞的【基金项目】江苏省高等学校自然科学研究面上项目“LncRNASLC25A34-AS1调控斑马鱼动静脉分化的机制研究”（2 0 KJB310028）；南通市科技计划项目“利用斑马鱼模型研究miR-22a调控血管芽生导向的机制”（JC2020104）；南通大学杏林学院大学生创新创业训练计划项目“Micall2a基因调控斑马鱼胚胎血管发育(2 0 18 139930 2 1xl)第一作者】杨晋娴(1990 一),女,硕士,讲师,研究方向：人类疾病与动物模型。E
10、-mail:通信作者】朱顺星（196 8），男，博士，副教授，研究方向：人类疾病与动物模型。E-mail:。O RCID：0 0 0 0-0 0 0 1-8 0 11-40 99实验动物与比较医学LaboratoryAnimal and ComparativeMedicineZebrafish;Vascular dependent diseasesJun.2023,43(3)模式动物与动物模型Model Animalsand Animal Models转移等有关1-3。迄今为止，研究者已发现在斑马鱼（D a n i o r e r i o）体内表达的8 个Mical家族同源基因，并且大多数斑马
11、鱼的Mical家族基因在神经系统和肌肉系Jun.2023,43(3)统中表达4。Micall2a是在斑马鱼心脏中检测到的5个同源物之一5-6 ，但其在斑马鱼心血管发育过程中的作用尚未见详细报告。目前，Mical家族的功能研究主要集中在无脊椎动物胚胎、成体组织以及脊椎动物的体外培养细胞中，但是其对于脊椎动物发育的具体功能仍然不清楚7 。心血管是斑马鱼胚胎发育中最早形成并行使功能的组织器官之一。斑马鱼心脏发育大概分为以下几个阶段：（1）最早于受精后5h（5 h o u r s p o s t-fertilization，5h p f），中胚层前外侧板出现心脏的前体细胞；（2）15hpf左右，心脏前
12、体细胞向胚胎中线处融合成心锥，然后向前延伸形成线性的心管；（3）约2 2hpf，心脏开始出现收缩；（4）2 8 hpf左右，心房和心室形成；（5）48 hpf左右，瓣膜形成，心房心室可清晰识别8 。和高等脊椎动物一样，斑马鱼的血管原细胞也来源于中胚层，1416 hpf迁移至躯干中线部位，并形成血管索；然后，血管原细胞分化形成血管细胞和造血细胞，血管细胞进一步分化形成轴向血管、背部主动脉和后主静脉，约2 4 hpf开始出现血液循环9。由于斑马鱼在血管发育研究方面具有优势，且Tg（f l i：GFP）转基因斑马鱼的血管内皮细胞被绿色荧光蛋白标记，可以通过激光聚集焦观察到斑马鱼的血管发育情况，因此它
13、是一种非常理想的动物模型【10 。生理性的血管生成是正常组织发育的必要条件，而包括肿瘤在内的一系列血管生成依赖性疾病中，病理性血管生成发挥关键作用。197 0 年代初Folkman提出肿瘤生长依赖于血管形成的概念1，此后大量研究证明肿瘤血管生成与肿瘤生长、侵袭和转移等特性密切相关，进而推动了肿瘤血管生成抑制疗法的产生。本实验利用转基因斑马鱼Tg（f li:G FP）和野生型斑马鱼（AB）为研究对象，采用全胚胎原位杂交技术，检测Micall2a基因在斑马鱼胚胎期不同发育阶段的表达情况，并通过显微注射吗啉反义寡核酸（mo r p h o l i n o a n t i s e n s e o l
14、i g o s，M o）法下调Micall2a基因表达，探究该基因在斑马鱼胚胎血管发育过程中的作用，为研究血管发育的调控机制提供实验依据，甚至为血管抑制相关的抗癌治疗提供新的思路。1材料与方法1.1实验动物本实验中使用的Tg（f l i G FP）转基因斑马鱼和野生型斑马鱼（AB）【12】均来自南通大学实验动物中心SCXK（苏）2 0 19-0 0 0 1，使用标准的斑马鱼养殖系实验动物与比较医学LaboratoryAnimaland ComparativeMedicine实验动物中心标准操作规程进行。1.2实验试剂焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate，D EPC）为生工生物
15、工程（上海）股份有限公司产品（货号B501005）。地高辛标记的原位杂交探针（Anti-Dig-AP，货号110 9 32 7 49 10）和蛋白酶K为美国Roche公司产品。琼脂糖为北京百晶生物技术有限公司产品（货号16 2 135）。氨苄西林（货号A9518）、柠檬酸（货号C2404）和酵母RNA（货号R362920）为美国Sigma公司产品。10 x磷酸盐平衡生理盐水（10 xPBS）为北京兰杰柯科技有限公司产品（货号2 12 352 97）。2 0 盐酸柠檬酸钠（saline sodium citrate，SSC）为美国Invitrogen公司产品（货号AM9770）。D NA M a
16、 r k e r、超凝胶核酸染色剂（货号GR501-01）、PCR扩增高保真酶2 phantaFlashMasterMix（货号P520-01）、高灵敏性染料法定量PCR检测试剂盒ChamQSYBRqPCRMasterMix（货号Q341-02）和第三代实时荧光定量PCR预混液（HiScript IRT Su p e r M i x f o r q PCR，货号R323-01）为南京诺唯赞生物科技股份有限公司产品。甲酰胺（货号R21111-500mL）为上海源叶生物科技有限公司产品。肝素（货号542 8 58）为北京百灵威科技有限公司产品。马来酸（货号M0375）为美国Sigma公司产品。SP6RNA聚合酶（货号P1085）为普洛麦格（北京）生物技术有限公司产品。TRIzol试剂盒（货号10296010）为美国Invitrogen公司产品。Tween-20为北京索莱宝科技有限公司产品（货号8 2 2 L0410）。BM-purple-AP（货号11442 0 7 40 0 1）为瑞士Roche公司产品。合成Micall2a基因反义RNA探针的PCR引物由南京金斯瑞生物科技股份有限公司合