1、：临床实验研究 突变致先天性肾上腺发育不全的分子诊断及致病机制 作者简介：李璃，年生，男，副主任技师，硕士研究生，从事产前诊断学研究。通信作者：许争锋，主任医师，：。李璃，刘刚，马定远，王亚，刘安，周静，季修庆，许争峰（南京医科大学附属妇产医院 南京市妇幼保健院产前诊断中心，南京）摘要：目的 对 例 基因突变所致的先天性肾上腺发育不全（，）患者进行分子诊断，以探讨其致病机制并为患者提供遗传咨询。方法 采集 例 患者及其家系成员的外周血标本并提取，通过 结合 测序对患者的 基因进行测序分析。结果在 例 患者 标本中分别检出 基因、半合子突变，并证实均遗传自其母亲。结论检出的 和 为未报道的新突变
2、，可判为致病突变，扩展了 基因突变谱系。关键词：基因；先天性肾上腺发育不全；测序；新突变中图分类号：；文献标志码：基因（，）又称剂量敏感的性别反转先天性肾上腺发育不良基因（，），该基因突变可导致一种罕见的 连锁先天性肾上腺发育不全（，），在普通人群中的患病率约为 。该遗传病的主要特征是从婴儿期到幼儿期的肾上腺功能不全，以及男性性腺功能减退症和男性不育。基因编码了 转录因子，该转录因子是细胞核受体超家族的成员，其在肾上腺发育和生殖功能及轴突中具有重要作用。基因突变通常导致原发性肾上腺功能不全和性腺功能减退。然而，也有学者报道了一些患者睾酮水平升高的病例。临床主要特征包括轻重度肾上腺功能不全，发作
3、时间以及生殖表现异常，且存在个体差异。亦有学者证实，轻度临床表型通常由突变蛋白残余部分活性所引起的。在 基因中已经报道了 多种突变（：），其中约三分之一的突变是小的缺失重复突变。本研究拟对 例 患者进行分子诊断，以探讨其致病机制，并为患者及其家属提供遗传咨询。资料与方法 病历资料 患者：男，岁 个月，出生 后因全身皮肤较黑、黄染住院。查体：腋下、乳晕及外生殖器色素沉着，口唇发绀，咽红，口腔黏膜见白色凝块不易拭去，颈软。实验室检查结果：胆红素 （参考区间：），皮质醇（）（参考区间：），促肾上腺皮质激素（）（参考区间：），（参 考 区 间：），羟孕酮（）（参考区间：），孕酮（）、睾酮（）均为正常。
4、该先证者被诊断为肾上腺危象和 病。先证者外公外婆近亲结婚，其姨母 月龄男婴亦患此病。患者：男，岁，出生时全身皮肤发黑、黄疸，岁时因发热，抽搐，昏迷，嗜睡，呕吐入院 治疗。查体：全身色素沉着明显，咽红，腹胀，双下肢肌张力高，阴囊肿胀，双侧睾丸鞘膜积液。实验室检查结果：，（参考区间：），（参考区间：），骨龄片相当于 岁，醛固酮及 均正常。肾上腺 提示单侧肾上腺萎缩。该先证者被诊断为肾上腺皮质功能不全、休克、肾上危象、低钠血症、支气管肺炎。患者：男，岁，出生时纳差拒食，黄疸、失盐。初诊败血症、细菌感染，后确诊为肾上腺皮质临床检验杂志 年 月第 卷第 期 ，功能减退。岁时皮肤色素沉着明显，开始予以氢化
5、可的松不规律治疗，岁无青春期启动，岁因该病复发再次入院。实验室检查结果：，的 次检测结果分别为 、（参考区间：），正常。本研究经南京市妇幼保健院医学伦理委员会审核批准（批准文号：宁妇伦字 号），并取得研究对象及其家属知情同意。主要仪器及试剂 扩增仪、基因分析仪、测序试剂盒（美国 公司），基因组 提取试剂盒、基因组 纯化分离试剂盒（北京天根生物公司），扩增试剂盒（，南京诺唯赞公司），超微量分光光度计（美国 公司）。标本采集及基因组 提取 采集各受检者及其家属成员的外周静脉血 ，置于 真空抗凝管中，按照血液 细胞 组织基因组 提取试剂盒说明书提取外周血基因组。所提取 样本的浓度及纯度要求：样本浓度
6、 ，总 量 ，吸光度（）值在 之间。基因序列分析 针对 基因（参考转录本）的 个外显子及其 端启动子区域，采用 软件设计 扩增引物，并由北京六合华大基因科技公司合成，引物序列见表。严格按照 扩增试剂盒说明书进行 扩增。反应条件：；，个循环；，保存。表 基因引物扩增序列及其产物长度引物位置引物名称正 反向引物序列（）产物大小（）退火温度（）注：因 基因第 号外显子序列较长（），使用 对引物对该区域进行扩增。扩增产物行 琼脂糖凝胶电泳并用基因组 纯化分离试剂盒进行纯化，使用同样的引物进行 测序反应。测序反应产物经纯化后，采用 基因分析仪进行 测序检测。测序结果应用 软件包中的 程序进 行 序 列
7、比 对，基 因 参 照 序 列 为。检索万方数据库、中国知网数据库、中文科技期刊数据库、人类基因突变数据库（，）、临床变异数据库（）、莱顿开放式变异数据库（，）及美国国立医学图书馆 相关文献，结合 年遗传变异分类标准与指南分析检出的突变是否被报道过并进行致病性分析。结果 基因检测分析结果 患者 被检出 基因存在 半合子突变，并证实遗传自其母亲；患者 被检出 基因存在 半合子突变，并证实遗传自其母亲；患者 被检出 基因存在 半合子突变，并证实遗传自其母亲。见图、表。注：为患者 基因 突变及其母亲的 测序峰图；为患者 基因 突变及其母亲的 测序峰图；为患者 基因 突变及其母亲的 测序峰图；箭头提示
8、相应突变的位置。图 例 患者 基因突变的 测序峰图临床检验杂志 年 月第 卷第 期 ，表 例 患者 基因突变分析结果病例突变基因核苷酸改变氨基酸改变合子型突变类型致病性评估来源新变异半合子移码突变致病母源是半合子移码突变致病母源是半合子无义突变致病母源否 注：基因参考转录本为。讨论 基因由 个外显子组成，编码 个氨基酸组成的细胞核受体超家族的一种孤儿蛋白（蛋白），该受体蛋白在结构上与位于其他核受体羧基末端的配体结合结构域相似，但在氨基末端缺 乏 典 型 的 锌 指 结 合 结 构 域。在 基因中已经发现了 多种不同的突变，其中大多数是无义或移码突变，导致蛋白质过早截断。本研究中描述的 对引物横
9、跨的序列区域几乎包含了现已报道的错义突变、无义突变和移码突变，同时这 对引物横跨启动区序列和全部编码区序列，故而结合这 对引物的 测序方法可被后续研究者或其他实验室借鉴使用。在本研究中，笔者纳入了 例男性患者，发现其均存在 基因突变。引起蛋白质改变为，引起蛋白质改变为，引起蛋白质改变为，均导致了 基因编码的 蛋白提前截断或终止，进而引起功能丧失。对其他家庭成员的进一步分析表明，其母亲是杂合子携带者。通过检索文献和数据库分析其致病性，基因的 和 移码突变迄今为止尚未在 患者中被报道过，是新的突变且可判为致病突变。无义突变在人类基因突变数据库 中已被收载，亦有文献报道原发性肾上腺皮质功能减退患儿存在该突变，为已知致病突变。的临床表型具有不典型性和多样性，因此 基因检测在 诊断中体现了其必要性和重要价值。如能早期诊断和及时治疗，可获得良好的预后。本研究中使用 测序方法检出了 个新的 基因突变，丰富 基因的突变谱系，同时也为这些家系提供较好的遗传咨询，指导生育下一代。参考文献，（）（）：，（）：，（）（，），（）：，（），（）：，（）：，（）：，（）：，（，）：，（）：，（）：王秋菊，沈亦平，邬玲仟，等 遗传变异分类标准与指南中国科学：生命科学，（）：，：，（）：，（），：，（）：（收稿日期：）（本文编辑：许晓蒙）临床检验杂志 年 月第 卷第 期 ，