1、实验研究USP14 抑制对肾缺血再灌注诱导的急性肾损伤及 IRE1/JNK 信号通路的影响黄霞1薛姗姗1李苏萌1徐芳1周涛2程成11泰州市人民医院检验科,泰州225300；2泰州职业技术学院医学系,泰州225300通信作者：程成，Email：开放科学（资源服务）标识码（OSID）【摘要】目的研究 USP14 的抑制是否可以减轻缺血再灌注（ischemia-reperfusion，IR）诱导的急性肾损伤以及潜在机制。方法通过对小鼠进行左侧肾动脉夹闭 45min 和再通建立体内肾IR 模型；HE 染色观察各组肾组织损伤情况；生化试剂盒检测血尿素氮（bloodureanitrogen，BUN）、肌酐
2、（serumcreatinine，Scr）水平；Westernblot 检测内质网（endoplasmicreticulum，ER）应激相关蛋白（GRP78、CHOP、IRE1 和 JNK）和凋亡相关蛋白（cleavedcapase-3 和 Bcl-2）的表达；通过 TUNEL 检测肾组织细胞的凋亡水平。结果与模型组比较，IR 组中小鼠肾损伤和肾功能障碍在再灌注期呈时间依赖性逐渐加重，肾组织中 USP14 的表达和 BUN 及 Scr 的水平增加（P0.05）；与 IR+sh-NC组比较，IR+sh-USP14 组中小鼠肾病理损伤及肾组织中 USP14、BUN、Scr 的水平降低（P0.05）
3、。此外，与模型组比较，IR 组小鼠肾组织中肾细胞凋亡，cleavedcaspase-3 和 ER 应激相关蛋白（GRP78、CHOP、IRE1、p-JNK）的表达升高，Bcl-2 的表达降低（P0.05）；与 IR+sh-NC 组比较，IR+sh-USP14组小鼠肾组织中肾细胞凋亡，cleavedcaspase-3 和 ER 应激相关蛋白表达减少，Bcl-2 的表达增加（P0.05）。结论抑制 USP14 可改善内质网应激和细胞凋亡，降低 IRE1/JNK 通路蛋白表达，从而减轻肾 IR 损伤。【关键词】急性肾损伤；再灌注损伤；泛素特异性蛋白酶 14；内质网应激；细胞凋亡基金项目：2020 年
4、年泰州市科技支撑计划（TS202027）DOI：10.3969/j.issn.1671-2390.2023.08.008Effects of USP14 inhibition on renal ischemia-reperfusion-induced acute kidney injury andIRE1/JNK signaling pathwayHuang Xia1,Xue Shan-shan1,Li Su-meng1,Xu Fang1,Zhou Tao2,Cheng Cheng11Department of Laboratory Medicine,People s Hospital,Tai
5、zhou 225300 China;2Department ofMedicine,Taizhou Polytechnic College,Taizhou 225300 ChinaCorresponding author：Cheng Cheng,Email:【Abstract】ObjectiveToexplorewhetherornotaninhibitionofUSP14canattenuateacutere-nalinjuryinducedbyischemiareperfusion（I/R）andelucidateitsunderlyingmechanisms.MethodsAnin viv
6、orenalI/Rmodelwasestablishedbyclampingleft-sidedrenalarteryfor45minandrecanalization.Renaltissueinjurywasobservedineachgroupafterhematoxylin-eosin（HE）stain.Serumlevelsofbloodureanitrogen（BUN）andcreatinine（Scr）weremeasuredbybiochemicalkits.Theexpressionsofendo-plasmicreticulum（ER）stress-relatedprotei
7、ns（GRP78,CHOP,IRE1&JNK）andapoptosis-relatedpro-teins（cleavedcaspase-3&Bcl-2）weredetectedbyWesternblot.ApoptoticlevelofrenaltissuecellswasdetectedbyterminaldeoxynucleotidyltransferasedUTPnick-endlabeling（TUNEL）.ResultsAscom-paredwithshamgroup,renalinjuryandrenaldysfunctioninI/Rgroupbecamegraduallywor
8、seinatime-dependentmannerduringreperfusionphaseandtheexpressionofUSP14andthelevelsofBUNandScrspikedinkidneytissue（P0.05）;ComparedwithI/R+sh-NCgroup,renalpathologicalinjuryandthelev-elsofUSP14,BUNandScrdeclinedinkidneytissuesinI/R+sh-USP14group（P0.05）.Inaddition,临床肾脏病杂志2023年8月第23卷第8期JClinNephrol，Augu
9、st2023，Vol.23，No.8663comparedwithshamgroup,renalcellapoptosis,theexpressionsofcleavedcaspase-3andGRP78,CHOP,IRE1&p-JNKroseandBcl-2declinedinkidneytissuesinI/Rgroup（P0.05）;ComparedwithI/R+sh-NCgroup,renalcellapoptosis,down-regulationsofcleavedcaspase-3andendoplasmicreticulum（ER）stress-relatedproteins
10、andup-regulationofBcl-2wereobservedinkidneytissuesinI/R+sh-USP14group（P0.05）.ConclusionsAninhibitionofUSP14amelioratesERstress,apoptosisandproteinexpres-sionofIRE1/JNKpathway,therebyattenuatingrenalI/Rinjury.【Key words】Acutekidneyinjury；ReperfusionInjury；Ubiquitin-specificprotease14；Endoplas-micreti
11、culumstress；ApoptosisFund program：TaizhouScienceandTechnologySupportPlanin2020(TS202027)DOI：10.3969/j.issn.1671-2390.2023.08.008肾缺血再灌注（ischemia-reperfusion，IR）损伤是急性肾损伤（acutekidneyinjury，AKI）的主要原因，其特征在于肾功能显著降低，高发病率和病死率1。肾 IR 损伤是危及生命的疾病，可能由低血容量状况如感染性休克、肾移植、肾和血管手术引起2。虽然目前在治疗肾 IR 损伤方面取得了一些进展，但仍缺乏有效的治疗方法
12、3。肾 IR 损伤的病理机制复杂，涉及内质网（endoplasmicreticulum,ER）应激、细胞凋亡、自噬、炎症反应和氧化应激4-5。多项研究表明，肾组织 ER 应激异常和细胞凋亡与肾 IR 损伤的发生发展密切相关6-8。随着肾 IR 损伤的重要性日益增加，迫切需要开发新的治疗方法来减少肾 IR 损伤的发生和发展。近年来，泛素特异性蛋白酶14（ubiquitin-specificprotease14，USP14）在 IR 后导致损伤中的作用逐渐引起关注。据报道，抑制 USP14 的表达可以减轻脑缺血再灌注引起的神经元损伤9。USP14 通过控制一些错误折叠蛋白质的蛋白酶体降解在肾细胞损
13、伤期间发挥重要作用10。然而，USP14 是否参与肾 IR 损伤有待进一步研究。此外，IRE1/JNK 是调控炎症反应、ER 应激和细胞凋亡等生物进程的关键信号通路。抑制肾小管上皮细胞中的 IRE1/JNK 通路可减轻 IR 诱导的 AKI11。IR 在短时间内刺激 ER 应激和肾小管中的 IRE1/JNK 通路，导致持续炎症和肾小球细胞外基质大量分泌，促进肾小球硬化，最终导致AKI 向慢性肾脏病转变12。因而 IRE1/JNK 信号是缓解 IR 诱导的 AKI 的潜在作用靶点。因此，本研究通过构建小鼠体内肾 IR 损伤模型，探讨 USP14对 IR 损伤及 IRE1/JNK 信号通路的影响。
14、材料与方法一、实验动物成年雄性 C57BL/6 小鼠，体重 2025g，由中国药科大学实验动物中心提供（动物许可证号：SYXK（苏）2021-0010），按照常规动物护理指南进行。所有小鼠在室温下进行 12h 的光照/黑暗周期，并自由获得不受限制的水和标准实验室饮食。本实验符合动物伦理。二、试剂与仪器RIPA 裂解液（上海碧云天生物技术公司）；泛素特异性蛋白酶 14（ubiquitin-specificprotease14，USP14）、CleavedCaspase-3、Bcl-2、GRP78、CHOP、IRE1、p-JNK、GAPDH 抗体和 HRP 标记的羊抗兔IgG（英国 Abcam 公
15、司）；HRP 底物（美国密理博公司）；表达 sh-NC 和 sh-USP14 的慢病毒（山东维真生物有限公司）；血肌酐（serumcreatinine，Scr）、血尿素氮（bloodureanitrogen，BUN）试剂盒（中国南京建成有限公司）；BCA 蛋白浓度检测试剂盒（上海纪宁生物）；末端脱氧核苷酸转移酶 dUTP 转移酶 缺 口 末 端 标 记（TUNEL）测 定 试 剂 盒（瑞 士Roche 公司）；蛋白电泳仪和蛋白转膜仪（美国 Bio-Rad 公司）；荧光显微镜 BX51（日本奥林巴斯公司）。三、方法1.肾 IR 模型的建立根据随机数字表法，将48 只小鼠随机分为假手术组（sham
16、 组）、IR 组、IR+sh-NC 组和 IR+sh-USP14 组，每组 6 只。术前将小鼠用戊巴比妥钠（50mg/kg）完全麻醉后置于恒温桌上。然后，所有小鼠都进行中线剖腹手术，小心地从周围组织中取出右肾，并进行肾切除术。中线切口后暴露左肾，非创伤性钳夹肾动脉 45min 后，放开动脉夹，然后在不同时期（6h、12h、24h和 48h）安乐死小鼠，收集标本。假手术组大鼠在不夹闭肾动脉的情况下进行腹部切口。最后，收获肾脏并在手术后收集血清。假手术组只切除右肾；IR+sh-NC 组和 IR+sh-USP14 组在 IR 模型建立前连续 10d 接受尾静脉注射 10mg/kgsh-NC 或 sh-664临床肾脏病杂志2023年8月第23卷第8期JClinNephrol，August2023，Vol.23，No.8USP14，每天 3 次。2.苏 木 精-伊 红 染 色（hematoxylinandeosinstaining，HE）首先对肾脏进行固定和包埋，然后制作 4m 厚的切片。切片逐渐脱蜡、水合，HE 染色。使用光学显微镜，以 200 倍放大率检查组织，并根据管腔内坏死细胞、细胞肿胀