1、书书书 年第 期（总第 期）畜禽业试验研究基金项目：江苏农牧科技职业学院项目（）；江苏省 高 等 学 校 大 学 生 创 新 创 业 训 练 计 划 项 目（）例蛋鸡混合感染的病原检测与分析苏晓健，赵永旺，吴双，车业贵江苏农牧科技职业学院，江苏 泰州 摘要为明确盐城某规模化养殖场蛋鸡死亡原因，针对 年冬季送检的 只患病蛋鸡进行了病理剖检、细菌分离鉴定和常规 检测。细菌分离鉴定结果表明分离到 株致病性大肠杆菌；检测结果包括 亚型 份、份、和 混感 份、和 混感 份、和 混感 份。结合临床症状、病理变化和实验室检测结果，该次疫情诊断为 、亚型 、和 混合感染。关键词 ；亚型 ；病原检测 ，；，；：
2、?引言冬春季节由于气候多变、昼夜温差大，成为鸡呼吸道疾病的高发时期。鸡呼吸道疾病大多由单一或多种病原混合感染引起，常见病原体有新城疫病毒（）、禽流感病毒（）、传染性支气管炎病毒（）、传染性喉气管炎病毒（）、副鸡嗜血杆菌（）、大肠杆菌（）、败血支原体（）、滑液囊支原体（）等。一旦发病往往快速蔓延至整个鸡群，病鸡一般表现出甩鼻、咳嗽、打喷嚏、张嘴呼吸等症状，产蛋期产蛋率下降，甚至出现死亡，给养殖场带来重大经济损失。鸡群中免疫抑制疾病的存在也是造成呼吸道疾病高发和难以防治的重要因素。免疫抑制疾病是指病原体通过破坏宿主的免疫器官或细胞，增加其对病毒、细菌和寄生虫病的易感性，并导致后续接种其他疫苗失败的
3、疾病 。常见引起免疫抑制疾病的病原体有传染性法氏囊病毒（）、禽白血病病毒（）、网状内皮增殖症病毒（）、鸡传染性贫血病毒（）、马立克氏病毒（）、禽腺病毒（）等。免疫抑制疾病在集约化大型鸡场中较普遍，给养鸡业带来很大危害。盐城是蛋鸡养殖大市，规模化程度高，饲养密度大，疾病流行复杂，防控难度大。年冬季部分鸡场出现严重的呼吸道疾病，蛋鸡产蛋率下降幅度大，并出现不同程度的死亡，给当地养鸡业带来巨大的经济损失。某发病较为严重的规模化鸡场，单栋 万只海兰褐蛋鸡，日龄。鸡群出现流泪、流鼻液、呼噜、怪叫、伸头缩颈、张口呼吸、口腔黏液增多、采食下降明显等症状，死亡 只 ，连续出现十几天死亡病例，产蛋率下降约 。为
4、确定当地流行的病原，对该规模化蛋鸡场采集病料进行了病原检测和分析，报告如下。?材料与方法 样品采集取病死鸡进行病理剖检观察病变，并无菌采集病试验研究 ，料心脏、肝脏、脾脏等组织，待检。试剂与仪器麦康凯培养基、营养琼脂培养基等购自青岛海博生物技术有限公司；微量生化鉴定管和药敏片购自杭州微生物试剂有限公司；、购自南京诺唯赞生物科技有限公司；反转录试剂盒购自 公司；提取试剂盒购自 ；购自 公司。生化培养箱购自宁波江南仪器厂；电泳仪购自北京市六一仪器厂；超净工作台和 仪购自 公司；凝胶成像系统、全自动化学发光图像分析系统购自 公司。细菌鉴定与药敏试验 细菌分离培养无菌采集病料心、肝接种于麦康凯培养基，
5、恒温培养 ，选取光滑圆整的单个典型菌落纯培养后冰箱保存。挑取纯化培养的菌落，抹片后革兰氏染色，镜检。生化试验把纯化培养后的细菌接种于肉汤培养基中，培养 后，接种到糖发酵、吲哚等 种微量生化鉴定管中，进行生化指标的测定 。致病性测定将 只 日龄健康雏鸡随机分为试验组和对照组，每组 只。将营养琼脂斜面上纯化后的菌落用生理盐水冲洗，采用倾注平板培养法计算活菌数，调整细菌浓度为 ，在试验组鸡腹腔注射细菌悬液 只，对照组注射生理盐水 只。接种后隔离饲养，记录发病及死亡情况。药敏试验选取大类 种抗菌药，参照 法 ，无菌操作将已经鉴定为鸡大肠杆菌的培养物，均匀涂布在营养琼脂培养基表面，间隔一定距离贴药敏试纸
6、片，于 恒温箱培养 ，测量药敏片的抑菌圈直径。检测无菌采集病死鸡的心、肝、脾等组织，与 按 混合后匀浆，制成混悬液，离心 ，取 上清液，用 抽提试剂盒提取样品中的核酸。以获得的核酸作为模板，开展 、亚型 、亚型 、亚型 、等能引起呼吸道症状和免疫抑制疾病的病原体检测。取适量的（）产物经 的琼脂糖凝胶电泳后观察结果。检测项目及片段大小如表 所示。表 检测项目及片段大小 检测项目片段大小检测项目片段大小?结果 临床剖检病死鸡剖检可见尸体苍白消瘦，血液稀薄，皮下组织和肌肉明显出血；气管出血，支气管内形成明显的黄色干酪样栓塞物；肺脏淤血、水肿、坏死；腹膜炎，腹膜上有明显的混浊样分泌物，感染严重的呈明显
7、的心包炎、肝周炎和气囊炎；胰腺充血、出血或呈斑点状黄白色坏死；十二指肠黏膜充血、出血，少数病死鸡可见腺胃乳头或肌胃角质膜下有轻度出血。细菌鉴定细菌培养结果显示在麦康凯培养基上长出粉红色、圆形扁平、边缘整齐、表面湿润光滑的菌落。挑取单个菌落进行革兰氏染色镜检，可见染色均匀，无芽孢，两端钝圆的革兰氏阴性短杆菌，符合大肠杆菌的形态特征，如图 所示。图 大肠杆菌革兰氏染色（）（）将分离的大肠杆菌进行生化试验鉴定，其能发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、果糖、甘露醇产酸产氧，部分发酵蔗糖。不能利用枸椽酸盐，甲基红试验呈阳性，伏波试验、硫化氢呈阴性。结果与大肠杆菌相符。年第 期（总第 期）畜禽业试验研究 致病性试验
8、雏鸡接种分离的大肠杆菌 后出现精神沉郁、采食减少、腹泻等症状，内雏鸡陆续死亡，剖检主要为肝脾肿大、心包积液等病变。无菌采集病死鸡的心脏、肝脏等组织进行细菌分离鉴定，结果与接种的菌株具有一致性，说明该菌株致病性很强。药敏试验分离的菌株对头孢曲松、卡那霉素、阿米卡星、恩诺沙星等 种抗生素敏感，对头孢噻呋、新霉素、氟苯尼考、替米考星、环丙沙星等 种抗生素中敏感性，对阿莫西林、氨苄西林、庆大霉素、多西环素、红霉素等种抗生素耐药，结果如表 所示。表 药敏试验结果 药物抑菌圈直径 敏感性药物抑菌圈直径 敏感性阿莫西林阿米卡星 氨苄西林多西环素头孢噻呋 氟苯尼考 头孢曲松 红霉素庆大霉素替米考星 卡那霉素
9、环丙沙星 新霉素 恩诺沙星 注：为敏感，为中介，为耐药。检测 检测共检测 份样品，其中 份样品 扩增后出现 的目的基因片段，说明 份样品中存在 感染，如图 所示。图 的 扩增结果 检测共检测 份样品，其中 份样品 扩增后出现 的目的基因片段，说明 份样品中存在 感染，如图 所示。图 的 扩增结果 亚型 检测共检测 份样品，其中 份样品 扩增后出现 的目的基因片段，说明 份样品中存在 亚型 感染，如图 所示。图 亚型 的 扩增结果 检测共检测 份样品，其中 份样品 扩增后出现 的目的基因片段，说明 份样品中存在 感染，如图 所示。图 的 扩增结果 份样品中 、亚型 、亚型 、病原检测结果均为阴性
10、。试验研究 ，混合感染结果共检测 份样品，其中 份 和 阳性，份 阳性，份 和 阳性，份 阳性，份 和 阳性，份阴性。结果如表 所示。表 检测结果 样品检测结果样品检测结果阴性 阴性 阴性 阴性 阴性对照?讨论 冬季鸡场常见疾病每年秋冬季都是鸡场呼吸道疾病高发的时期。给养鸡业带来严重影响，大多患鸡会表现出呼吸道症状，这可能与禽类呼吸系统的特殊结构有关。家禽有个气囊与肺脏相连，病原容易通过呼吸道进入气囊并潜伏、增殖。由于胸腹腔之间无横膈膜，病原很容易扩散到胸腹腔器官造成感染。引起鸡呼吸道疾病的病原种类繁多，常见的有 、等。这些病原常相互继发，造成混合感染，给防治带来极大的困难。免疫抑制疾病在养禽
11、业中较为常见，能够损害免疫系统造成免疫抑制，有时可能存在几种病毒同时感染鸡群的情况，导致鸡群的发病率和死亡率大大升高，对养禽业的发展以及经济效益造成巨大威胁 。临床常见的造成鸡免疫抑制的病原主要有 、等。疫情分析该次试验对发病鸡场采样进行了细菌分离鉴定，并用 方法检测了能引起鸡呼吸道症状和免疫抑的常见病原：、（、）、等。细菌分离鉴定为致病性大肠杆菌，检测结果显示 亚型 、阳性。检测结果结合临床，该次疫情诊断为 、亚型 、混合感染。在规模化鸡场同时感染 种病原的情况较少见，但这也说明家禽养殖中混合感染的的问题变得越来越复杂，应高度重视。该次试验对采集的 份样品进行了 检测，其中 份样品 阳性，份
12、样品 亚型 阳性，份样品 阳性，份样品 阳性，说明 和 亚型 在鸡群中感染非常普遍，是造成这次疫情的主要原因，应重点防治。不仅可以垂直传播还能水平传播，规模鸡场只要有少量鸡出现发病，不久就会扩散至整群甚至整场 。若产蛋鸡群在开产初期感染，会导致产蛋率上升慢，而且无产蛋高峰；在高峰期发病则导致产蛋率下降 ，严重影响经济效益 。姜泊宇 等 对江苏省某鸡场 日龄雏鸡调查结果表明 检出率为 。徐琦等 调查发现我国 个省（市）的 个未免疫 疫苗的祖代种鸡场鸡群 血清抗体阳性率为 ，感染较为普遍，并且大部分阳性场都存在向父母代场垂直传播 的风险。该次感染是否和垂直传播有关，还需进一步调查。可引起雏鸡骨髓造
13、血组织和胸腺等淋巴组织萎缩，进而导致贫血和免疫抑制 。引起的免疫抑制可造成其他病种免疫失败。李鑫 研究表明 感染可显著降低 灭活疫苗和活疫苗的免疫效果。该次疫情中 亚型 感染可能和免疫失败有关，亚型 的免疫失败可能是鸡群中长期存在 感染造成的。亚型 致病力不高，主要引起呼吸道症状和产蛋率下降，通常不会造成家禽的死亡，但会造成机体免疫力降低，细菌黏附定植能力增强。临床上感染 亚型 的鸡群容易继发上呼吸道细菌及消化道细菌感染，导致 亚型 致病力增强，从而造成死亡率显著升高。另外，亚型 还能与 、等发生混合感染，病毒入侵时有可能出现协同作用或拮抗作用，从而相互促进或抑制病毒的复制和排毒 。李汶蔓 等
14、 报道 例蛋鸡 、亚型 和 混合感染病例，该养殖场病例发病急，发病率高，初期死亡率高，后期死亡率趋于稳定。该次疫情，鸡群病死率较高，可能与 亚型 继发了大肠杆菌的感染有很大关系。年禽腺病毒在江苏一带呈零星发展趋势，自 年开始呈暴发流行趋势，虽然大多数养殖场已经采取措施，但是仍存在禽腺病毒的隐性感染，困扰着养禽业的健康发展 。调查结果显示，发病家禽普遍存在 与其他免疫抑制性 年第 期（总第 期）畜禽业试验研究病原混合感染的情况，如 、和 。对肉鸡表现出很强的致病性，在临床中能够横向通过粪便途径在鸡群甚至农场间传播，野生鸟类 抗体阳性率较高，这表明野生鸟类可能是病原的携带者，在自然条件下可能成为疾
15、病传播的特定宿主 。近年来，马立克氏病在鸡中的发病率越来越高。马立克氏病是鸡的一种高度传染性、淋巴细胞增生性疾病。为免疫抑制性病毒，其感染能引起鸡体不同器官的病变、免疫器官的萎缩，降低鸡体抵抗力，并能 够 抑 制 疫 苗 免 疫 后 的 抗 体 反 应 。研究证明 感染能显著降低 疫苗对 的保护作用，这意味着同时感染 可能是近年来中国 频繁发作的主要原因。该次检测只有 份样品 和 阳性，虽然阳性率不高，但鸡群中确实存在 和 ，二者在该次疫情中也起了一定作用，使感染情况更加复杂，给防治工作带来更大的困难。大肠杆菌病是鸡场的常见病，临床表现复杂多样，可以单独发病，也容易继发感染，发病率、死亡率都比
16、较高，一旦治疗不及时，就会造成严重的经济损失。但各种抗生素的广泛使用也致使大肠杆菌的耐药性不断增强，耐药谱不断变宽，多重耐药菌株越来越多。该试验分离的菌株对阿莫西林、氨苄西林、庆大霉素、多西环素、红霉素、头孢噻呋、新霉素、氟苯尼考、替米考星、环丙沙星等产生了不同程度的耐药性，给临床治疗工作带来极大的困难。并且大肠杆菌对 亚型 有很好的协同致病能力，其释放的毒素可以促进 对宿主细胞的感染范围、宿主炎性因子和趋化因子的表达水平显著升高，进而导致严重的心包炎、肝周炎、腹膜炎和气囊炎等，鸡群死淘率直线上升。因此，在该次疫病的发生过程中，很可能鸡群最先感染了 ，感染会破坏机体免疫器官，造成免疫抑制，导致 亚型 免疫失败。亚型 在鸡群流行，继发了大肠杆菌感染，和 也起到了“帮凶”的作用，造成鸡群持续出现大量死亡。?结论引起盐城某养殖企业产蛋鸡群发病的原因是 、亚型 、混合感染。参考文献：，（），（）：陆承平 兽医微生物学 北京：北京中国农业出版社，：黎敏，徐丘，陈礼斌，等 鸡几种重要免疫抑制性疾病的流行现状和防控 养禽与禽病防治，（）：薛冬梅 鸡传染性贫血的流行病学、临床特征、实验室诊断和防控措施