1、5种常用病毒灭活剂的应用概述史大庆，肖永珍，陈汉林，陈金仙，王灵，齐冬梅，林德锐*（广东永顺生物制药股份有限公司，广东 广州 511356）摘 要：病毒灭活是利用物理或化学方法使病毒失去感染性的过程。病毒的灭活效率常受到病毒特性、灭活剂种类、灭活目的等多个因素的影响。通常病毒特性和病毒灭活后的用途决定了灭活剂的选择，疫苗研制需病毒完全灭活的同时保持病毒保护性抗原表位结构完整，以诱导有效的宿主免疫反应；分子生物学检测则需要病毒基因组完整等。因此选择适宜的灭活剂对高致病性病原进行灭活是病原分子诊断、血清学分析以及疫苗开发等后续工作的重要保障。目前越来越多的病毒灭活剂被开发和利用，本文选择5种实际工
2、作中常用的化学类病毒灭活剂：甲醛（Formaldehyde）、丙内酯（propiolactone）、胍基离序盐（Guanidium based chaotropic salts）、补骨脂素（Psoralen）、过氧化氢（Hydrogen peroxide），对其灭活机理、病毒灭活特点以及灭活病毒在后续工作中的应用进行如下概述。关键词：甲醛；丙内酯；胍基离序盐；补骨脂素；过氧化氢；病毒灭活中图分类号：S851.66文献标识码：A文章编码：10058567（2023）04006606Overview of Five Frequently Used Virus InactivatorsSHI Daq
3、ing，XIAO Yongzhen，CHEN Hanlin，CHEN Jinxian，WANG Ling，QI Dongmei，LIN Derui*（Guangdong Winsun BioPhamaceutical Co.，Ltd，Guangzhou Guangdong 511356）Abstract：Virus inactivation is the process of using physical or chemical methods to make the virus loseinfectivity.The virus inactivation efficiency is ofte
4、n affected by many factors，such as virus characteristics，types ofinactivators and the aims of inactivation.The selection of inactivators is usually determined by the characteristics of thevirus and its use after inactivation.Vaccine development requires complete inactivation of the virus while maint
5、ainingthe integrity of the viral protective antigen epitope structure to induce an effective host immune response.Molecularbiological detection requires complete viral genome integrity.Therefore，selecting appropriate inactivators to inactivatehighly pathogenic pathogens is an important guarantee for
6、 subsequent work such as pathogen molecular diagnosis，serological analysis，and vaccine development.At present，more and more virus inactivators are being developed andutilized.In this paper，5 chemical virus inactivators frequently used are selected，namely formaldehyde，propiolactone，guanidium based ch
7、aotropic salts，psoralen，hydrogen peroxide，the inactivation mechanism andinactivation characteristics of the aboved virus inactivators，along with the application of inactivated virus aresummarized as follows.Keywords：Formaldehyde；propiolactone；Guanidium based chaotropic salts；Psoralen；Hydrogenperoxid
8、e；Virus inactivation收稿日期：20221009作者简介：史大庆（1978年生），男，兽医师，研究方向：兽用生物制品。Email：*通讯作者：林德锐（1978年生），男，高级兽医师，研究方向：兽用生物制品。Email：专题综述广东畜牧兽医科技广东畜牧兽医科技2023年（第48卷）第4期Guangdong Journal of Animal And Veterinary ScienceDOI:10.19978/ki.xmsy.2023.04.12 66高致病性病毒的灭活是病毒分子诊断、血清学分析以及疫苗开发的重要环节。根据灭活作用的性质可分为物理灭活和化学灭活。物理灭活包括热灭
9、活、紫外光、射线灭活等。化学灭活主要指利用一些化学试剂达到灭活的效果，常用的病毒灭活剂有：甲醛、丙内酯、二乙烯亚胺、胍基离序盐、光活性化合物（如补骨脂素或叠氮化物等）、芳香族二硫化物、过氧化氢、乙醇等；还有其他灭活剂如清洁剂 Tween20、Triton X100或十二烷基硫酸钠（SDS）等也被用于病毒灭活1。病毒种属特性和灭活后病毒的用途是选择灭活剂和灭活方法的决定因素，如：血清学分析和疫苗研制要求病毒灭活完全，且灭活病毒的蛋白质结构完好，特别是保持能够诱导产生中和抗体的抗原表位蛋白结构完整，以诱导有效的宿主免疫反应；而分子生物学检测则需要病毒基因组完整2。病毒灭活效率还会受到诸如病毒效价、
10、病毒液的储存基质（组织源、细胞源、血清源、胚源等）、pH值、无机盐含量、其它蛋白质含量、灭活辅助设备和环境等多种因素的影响。本文对甲醛、丙内酯、胍基离序盐、补骨脂素、过氧化氢等常用的化学类病毒灭活剂的灭活机理、病毒灭活特点以及灭活病毒在后续分子生物学检测、血清学评估、疫苗研发等一个或多个方向的应用进行如下概述。1甲醛（Formaldehyde）甲醛是一种有机化合物，化学式是HCHO或CH2O，是无色有强烈刺激性气味的气体。是WHO认定的一类致癌物。在实际工作中常常使用含量为37%40%的甲醛水溶液即福尔马林进行病毒灭活。甲醛易溶解于水形成水合亚甲基，可导致由羟甲基基团、席夫碱和亚甲基桥等多元化
11、的修饰作用，形成核酸蛋白质和蛋白质蛋白质交联3。其中羟甲基和希夫碱的形成是可逆的，通过电喷雾电离质谱（Electrospray ionization mass spectrometry）可以发现羟甲基和希夫碱衍生物位于氨基或巯基的残基上。由甲醛引起的多肽或蛋白质最重要的修饰是形成稳定的亚甲基桥，首先甲醛与多肽或蛋白质的氨基和巯基发生反应，然后与精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、色氨酸和酪氨酸等氨基酸残基形成交联4。亚甲基桥使蛋白质分子间或分子内形成交联。同时这些反应还可以在基因组与蛋白质之间形成核酸蛋白质交联，导致基因组功能失调。另外，核酸腺嘌呤上的非质子化外环胺作为亲核基团，可与甲醛碳正离
12、子发生反应完成腺嘌呤的单羟甲基化（即烷基化），阻碍DNA复制和RNA转录5。因此，使用甲醛灭活对病毒的基因组和蛋白质都有影响。1.1血清学检测在血清学分析中，甲醛可保存细胞结构，是一种常见的固定剂，可用于电子显微镜、免疫荧光分析和流式细胞仪分析等。4%多聚甲醛固定严重急性呼吸综合征冠状病毒 2（severe acute respiratorysyndrome coronavirus 2，SARSCoV2）感染的细胞，可以有效地灭活SARSCoV26。呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus，RSV）融合前构象的F蛋白极不稳定，使用浓度为0.2667%-0.0156
13、%甲醛灭活12 h，病毒40%-60%的融合前构象F蛋白被保留；小鼠免疫中和抗体水平提高了 45倍7。1.2疫苗开发自20世纪20年代以来，甲醛一直是人用和兽用疫苗研发和生产中最常用的灭活剂。临床上已成功地应用于多个人用灭活苗，如甲型肝炎病毒灭活疫苗：HAVRIX、VAQTA、AVAXIM、Aimugen及中国医学科学院医学生物研究所生产的维赛瑞安等；钩端螺旋体灭活苗：赛诺菲巴斯德生产SPIROLEPT和古巴研制开发的vaxSPIRAL等；以及脊髓灰质炎病毒、日本脑炎病毒、蜱传脑炎病毒、RSV 等病毒灭活疫苗3，89。目前，兽用灭活疫苗中如新城疫、禽流感、传染性支气管炎等禽用病毒灭活疫苗多使用
14、甲醛进行病毒灭活。在疫苗制备过程中，甲醛的灭活效果受到诸如：病毒种类、灭活温度、病毒液的pH和浓度等多种因素的影响。使用甲醛灭活病毒会出现病毒灭活不彻底的现象，多由甲醛使用浓度不恰当或灭活时间不充分引起；也有可能是病毒核衣壳蛋白与RNA发生交联，RNA不能被降解，一些病毒颗粒逃脱了甲醛的影响未被灭活，导致灭活不彻底5。2丙内酯（BetaPropiolactone，BPL）BPL为四元环内酯类有机化合物，化学式为5种常用病毒灭活剂的应用概述史大庆，等专题综述 67C3H4O2，无色液体，易溶于水。BPL是病毒DNA或RNA鸟嘌呤上的烷基化剂，核酸的鸟嘌呤通过亲核取代机制与亲电的BPL试剂反应，完
15、成鸟嘌呤的烷基化；抑制转录导致病毒失活，但不损害病毒衣壳蛋白10。BPL可水解为无细胞毒性的乳酸和羟基丙酸，因此可通过水解作用去除灭活液中残留的BPL5。适宜浓度的BPL能够充分发挥病毒灭活的作用，浓度过高则会影响结构蛋白的抗原完整性，还可使病毒粒子大量聚集，导致灭活不完全和免原性降低。BPL被广泛用于病毒灭活疫苗的研制与生产实践，使用频次仅次于甲醛。BPL临床上已用于黄热 病（Yellow fever）、流 感（Influenza）、狂 犬 病（Rabies）等人用病毒病疫苗及鳜传染性脾肾坏死病病毒（Infection spleen and kidney necrosis virus，ISK
16、NV）和弹状病毒（Siniperca chuatsi rhabdovirus，SCRV）、大 鲵 虹 彩 病 毒（Giant SalamanderIridovirus，GSIV）等多种鱼类病毒病疫苗的抗原灭活1112。特别地，近三年BPL也广泛的应用于生产SARSCoV2全病毒灭活疫苗，如国药集团北京生物制品研究所的BBIBPCorV疫苗和北京科兴中维生物技术有限公司的CoronaVac疫苗1316。大量临床应用说明BPL灭活病毒制备的灭活疫苗，能够诱导良好的保护性免疫反应。3胍 基 离 序 盐（GuanidiumBasedChaotropic Salts，GBCS）GBCS通常为核酸提取液的主要成分，用于病毒 灭 活 的 GBCS 主 要 为 含 有 异 硫 氰 酸 胍（Guanidinium Isothiocyanate，GI）、苯酚或 Tritonx100、硫氰酸胍（Guanidium thiocyanate，GTC）等的缓冲液。GBCS灭活病毒可破坏病毒囊膜和降解细胞核酸酶，保持病毒的核酸结构。GBCS处理过的病毒样品能够满足分子生物学分析要求，但不能用于血清学和免疫学分析，因