1、 J Clin Transfus Lab Med,June.2023,Vol 25,No.3342DOI：10.3969/j.issn.1671-2587.2023.03.009作者单位：100088 北京市红十字血液中心作者简介：许志远，副主任技师，硕士，主要从事血型血清学和分子免疫血液学研究，（E-mail）。论著4例ABO和Rh血型嵌合体的血清学及分子生物学基础研究许志远 李晓菲 刘婷婷 张烨 苗天红 【摘要】目的 研究血型嵌合体的血清学特征分子生物学确认方法。方法 对4例医院输血科送检做ABO和RhD血型的患者，进行ABO和Rh血型鉴定、毛细管离心分离新生红细胞、吸收试验、DTT处理凝
2、集红细胞试验，同时对患者1的血样进行分子生物学研究。结果 患者1：ABO血型为AB/B型嵌合，Rh血型为RhCE基因嵌合；患者2：Rh血型为RhD基因嵌合；患者3：ABO血型为AB/B型嵌合，Rh血型为RhD基因嵌合；患者4：ABO血型为O/B型嵌合，Rh血型为RhCE基因嵌合。结论 在血型血清学上，排除患者有近期输血史，同时又不存在使患者抗原减弱的疾病情况下，ABO和Rh血型出现混合外观现象是其主要特征，实验人员可依据此怀疑患者是有血型嵌合体的可能通过血清学和分子生物学方法进行确认。【关键词】血型嵌合体 ABO嵌合 Rh嵌合 毛细管离心 熔解曲线 【中图分类号】R457 【文献标识码】A 【
3、文章编号】1671-2587（2023）03-0342-07Four Cases of ABO and Rh Blood Group Chimera of Serology and Molecular Biology Basic Research XU Zhiyuan,LI Xiaofei,LIU Tingting,et al.Beijing Red Cross Blood Center,Beijing 100088【Abstract】Objective To study the serological characteristics,the strategy of blood transfu
4、sion and the molecular method of chimera.Methods The serology test of ABO and Rh blood group were done to confirm the four patients ABO and RhD blood group from hospital.Separation of newborn red blood cells by capillary centrifugation,absorb test,DTT treatment of agglutination erythrocyte test and
5、molecular biological identification for one case.Results the patient 1,the blood group of ABO is AB/B chimeras,the blood group of Rh is the gene of RhCE chimeras;the patient 2,the blood group of Rh is the gene of RhD chimeras;the patient 3,the blood group of ABO is AB/B chimeras,the blood group of R
6、h is the gene of RhD chimeras;the patient 4,the blood group of ABO is O/B chimeras,the blood group of Rh is the gene of RhCE chimeras.Conclusions In terms of blood group serology,the main characteristic is mixed appearance on ABO and Rh blood groups in the absence of a recent history of transfusion
7、and a disease that weaken the patients antigens.Based on this,if there is a suspicious blood group chimera it can be confirmed by serological and molecular biological methods.【Key words】Blood group chimera ABO chimera Rh chimera Capillary centrifugation Melting curve嵌合体在遗传学上用以指不同遗传性状嵌合或混杂表现的个体。免疫学上是
8、指一个个体身上有两种或两种以上染色体组成不同的细胞系同时存在，彼此能够耐受，不产生排斥反应，相互间处在嵌合状态。按照不同的目的和意义可分类为：同源性嵌合体（又称“马赛克”）和异源性嵌合体（又称“开米拉”）1；先天性嵌合体和获得性嵌合体；血型嵌合体和器官嵌合体。目前嵌合体的研究主要集中在骨髓和造血干细胞移植，产前遗传性疾病的诊断分析方面，但是在输血研究方面，国内还鲜有文献报道。近期本室发现4例血型嵌合体患者，现报告如下。材料与方法1 病例材料 患者1，女，53岁，无输血史，有妊娠史，脑膜瘤，送本室鉴定ABO血型。患者2，女，81岁，无输血史，有妊娠史，卵巢和子宫肌瘤，送本室鉴定RhD血型，患者3
9、，男，73岁，无输血史，前列腺增生，送本室鉴定ABO血型和RhD血型。患者4，女，27岁，无输血史，妊娠史不详，妊娠水肿，送本室鉴定ABO血型。送检血样均为EDTA抗凝血样2 mL。2 试剂与仪器 2.1 血清学试剂：抗-A（批号：102141）、抗-B（批号：204141）由美国Immucor公司提供；反定型细胞（批号：20185309）由上海血液生物医药有限责任公司提供；IgM抗-D（批号：V187175）由Baso公司提供；抗-A1（批号：8000215024）、抗-H（批号：8000230758）由荷兰Sanquin公司提供；直抗分型卡（批号：50560.78.04）、ABD复检卡（批
10、号：50063.83.01）由美国Bio-Rad公司提供；Rh血型卡（批号：201802008）由江苏力博医药生物技术股份有限公司提供；0.01M DTT、人源ABO抗体由本室自临床输血与检验2023年6月第25卷第3期343取基因型分别为R1R2、R1R1、R2R2、AA、AO、BO、AB、BB的血样分别提取DNA，作标准品使用。3.5.2 ABO、Rh血型嵌合体的确认：患者1和标准品DNA浓度保持一致，DNA浓度要求：（702）ng/L，同时进行荧光PCR试验（所需引物及扩增程序为实验室自行设计研发），进行熔解曲线荧光值的比较，利用不同温度下形成的熔解曲线，确认患者1是否为嵌合体血型。结
11、果1 ABO和Rh血型 结果见表1和表2。2 毛细管离心 结果见表3和表4，结果显示毛细管离心前、后4个患者的ABO和Rh血型均无变化。3 吸收试验 患者1和患者3用抗-A吸收、患者4用抗-B吸收、患者2用抗-D吸收，对吸收后不凝集红细胞分别做ABO和Rh分型；同时用DTT处理凝集红细胞后分别做ABO和Rh血型。结果见表5。血清学结果显示患者1为B、CCDee/AB、CcDEe血型嵌合；患者2为B、CCdee/B、CcDEe血型嵌合;患者3为B、Ccdee/AB、CcDee血型嵌合；患者4为B、CCDee/O、CcDEe血型嵌合。4 分子生物学结果4.1 ABO血型嵌合确认：我们利用A基因特异
12、性引物分别对标准AA型、AB型、OO型和患者1进行定量扩增（模板DNA浓度一致），结果显示荧光值：AA型AB型患者1OO型，结果如图1所示，同理，利用B基因特异性引物分别对标准BB型、AB型、OO型和患者1进行定量扩增（模板DNA浓度一致），结果显示荧光值：BB型患者1AB型OO型，结果如图2所示。制；KA-2200离心机（日本久保田）、Kubota 3220毛细管离心机（日本久保田）；孵育器、离心机（美国Bio-Rad公司）。2.2 分子生物学试剂：核酸提取 DNA的提取在血样采集后12小时内完成，核酸提取运用磁性微珠分离技术（chemagic Magnetic Separation Mod
13、ule I），使用磁珠试剂（Prepito DNA Blood 250 Kit，Chemagen，Germany）在全自动核酸提取仪（Chemagic Prepito，Chemagen，Germany）完成，核酸样本保存于40直至分子生物学分析。荧光PCR和基因测序引物为本试验室依据GENBENK数据库自行设计，荧光定量PCR扩增仪（美国ABI）。3 方法3.1 ABO、RhD血型鉴定：使用试管法、血型复检卡按操作规程鉴定。3.2 Rh分型：使用Rh分型卡，按照试剂说明书进行操作。3.3 吸收试验（分离两群红细胞）：患者1和患者3红细胞用人源抗-A试剂吸收；对患者2红细胞用IgM抗-D试剂吸收
14、；对患者4红细胞用人源抗-B试剂吸收。对吸收后不凝集红细胞应用试管法、微柱凝集卡做ABO血型鉴定和Rh分型；吸收后凝集红细胞用0.2M DTT处理后，分别做ABO和Rh血型鉴定。3.4 毛细管离心：将患者靠近白膜层的红细胞用生理盐水洗涤3遍后，取压积红细胞，充分混匀，加至毛细管中离心，取近心端5 mm内红细胞进行ABO和Rh血型鉴定。3.5 分子生物学检测方法3.5.1 标准品的制备：分别选取A型、B型、O型、AB型RhD样本，应用荧光PCR方法，鉴定其基因型，选 表1 患者1、2、3、4的ABO血型血清学结果（试管法）患者抗-A抗-B抗-A1抗-HAcBcOc自身14+mf4+4+mf1+0
15、000204+/1+4+00034+mf4+4+mf1+0000404+mf/2+4+000注：mf表示混合外观。表2 患者1、2、3、4的Rh血型血清学结果（Rh分型卡）患者抗-C抗-c抗-D抗-E抗-e14+4+dcp4+4+dcp4+24+4+dcp4+dcp4+dcp4+34+4+4+dcp04+44+4+dcp4+4+dcp4+注：dcp表示混合外观。J Clin Transfus Lab Med,June.2023,Vol 25,No.3344 表4 患者1、2、3、4毛细管离心前后Rh分型卡结果患者毛细管离心抗-C抗-c抗-D抗-E抗-e1前4+4+dcp4+4+dcp4+后4+
16、4+dcp4+4+dcp4+2前4+4+dcp4+dcp4+dcp4+后4+4+dcp4+dcp4+dcp4+3前4+4+4+dcp04+后4+4+4+dcp04+4前4+4+dcp4+4+dcp4+后4+4+dcp4+4+dcp4+表5 患者1、2、3、4吸收后不凝集和凝集红细胞ABO和Rh血型结果患者吸收试剂红细胞抗-A抗-B抗C抗-c抗-D抗-E抗-e结论1抗-A不凝集04+4+04+04+B/CCDee凝集4+4+4+4+4+4+4+AB/CcDEe2抗-D不凝聚04+4+0004+B/CCdee凝集04+4+4+4+4+4+B/CcDEe3抗-A不凝集04+4+4+004+B/Ccdee凝集4+4+4+4+4+04+AB/CcDee4抗-B不凝集004+4+4+4+4+O/CcDEe凝集04+4+04+04+B/CCDee4.2 Rh血型嵌合确认：分别利用C、c、E、e特异性引物扩增患者1和R1R1、R2R2、R1R2，结果如图3、图4、图5、图6所示，表明患者在RhCE基因上存在嵌合现象。表3 患者1、2、3、4毛细管离心后ABO血型卡结果患者毛细管离心抗-A抗-B1前4+