1、实验五实验五 经典免疫学检测技术：经典免疫学检测技术：抗原抗体凝集实验和抗原抗体沉淀实验抗原抗体凝集实验和抗原抗体沉淀实验 一一 、凝集反响、凝集反响 二二 、沉淀反响、沉淀反响 一、凝集反响(一一)ABO)ABO血型鉴定实验血型鉴定实验 凝集反响：在一定浓度的电解质溶液中，颗凝集反响：在一定浓度的电解质溶液中，颗粒性抗原粒性抗原(如红细胞如红细胞)与相应抗体结合后，出与相应抗体结合后，出现肉眼可见的凝集块。由于凝集反响方法简现肉眼可见的凝集块。由于凝集反响方法简便，目前在临床检验中仍被广泛应用。便，目前在临床检验中仍被广泛应用。抗原：能诱导机体产生体液抗体和细胞免疫应答，抗原：能诱导机体产生
2、体液抗体和细胞免疫应答，并能与抗体和致敏淋巴细胞在体外发生特异结合反并能与抗体和致敏淋巴细胞在体外发生特异结合反响的物质。响的物质。抗体抗体免疫球蛋白免疫球蛋白：机体在抗原物质刺激下所形：机体在抗原物质刺激下所形成的一类能与抗原特异结合的血清活性成分。成的一类能与抗原特异结合的血清活性成分。人类人类ABOABO血型抗原主要有血型抗原主要有A A和和B B两种，根据两种，根据红细胞外表这两种抗原的有无红细胞外表这两种抗原的有无,可把血型分为可把血型分为四种。据此，将抗四种。据此，将抗A A和抗和抗B B的抗体分别与待测的抗体分别与待测红细胞混合，抗红细胞混合，抗A A或或和和抗抗B B的抗体与红
3、细的抗体与红细胞外表上的相应抗原结合而引起红细胞凝集，胞外表上的相应抗原结合而引起红细胞凝集，据其凝集情况便可判定出受试者的血型。据其凝集情况便可判定出受试者的血型。1.ABO1.ABO血型鉴定实验原理血型鉴定实验原理 红细胞表面红细胞表面AgAg 血清中血清中AbAb A A型型 A A 抗抗B B B B型型 B B 抗抗A A ABAB型型 A A、B B 、O O型型 、抗抗A A、抗、抗B B ABOABO血型的划分血型的划分 1 1ABOABO血型鉴定试剂盒内含血型鉴定试剂盒内含:抗抗A A血清：为蓝色血清：为蓝色 抗抗B B血清：抗血清：抗B B为黄色为黄色 2 2一次性采血针一
4、次性采血针1 1枚、洁净玻片、枚、洁净玻片、7575酒精、灭菌棉签。酒精、灭菌棉签。3 3生理盐水生理盐水 2.2.实验材料实验材料 3.3.实验方法实验方法 1 1取载玻片取载玻片1 1张，用记号笔划分为两格，分别注明张，用记号笔划分为两格，分别注明A A和和B B，各加，各加1 1滴标准抗滴标准抗A A和抗和抗B B的血清的血清抗体抗体。每每人一张玻片人一张玻片 抗抗B 血清 抗抗A 血清 A B 3.3.实验方法实验方法 2 2采血：酒精棉球消毒耳垂或手指末端后，用采采血：酒精棉球消毒耳垂或手指末端后，用采血针刺破皮肤，取血针刺破皮肤，取1 1滴血滴血可用牙签可用牙签直接放入抗直接放入抗
5、A A、抗抗B B血清。血清。+抗抗A血清血清 +抗抗B血清血清 A B 3.3.实验方法实验方法 不凝集不凝集-凝集凝集+如混合液由均匀红色混浊状逐渐变为透明，并出现大小不如混合液由均匀红色混浊状逐渐变为透明，并出现大小不等的红色凝集块者，即为红细胞凝集；如混合液仍呈均匀等的红色凝集块者，即为红细胞凝集；如混合液仍呈均匀混浊状，那么为不凝集。混浊状，那么为不凝集。3 3手持玻片，前后左右轻轻转动，促手持玻片，前后左右轻轻转动，促其充分混匀。其充分混匀。A B 记录受检者红细胞凝集情况，根据记录受检者红细胞凝集情况，根据ABOABO血型鉴定表，判断受检者的血型。血型鉴定表，判断受检者的血型。实
6、验结果实验结果 结论结论 抗抗A血清血清 抗抗B血清血清 +-+-4.4.实验结果实验结果 玻片用后，酒精擦过后，放入消毒缸内！玻片用后，酒精擦过后，放入消毒缸内！(二二)志贺杆菌玻片凝集实验志贺杆菌玻片凝集实验 1.1.材料材料 志贺杆菌诊断血清志贺杆菌诊断血清(抗体抗体)；待鉴定细菌待鉴定细菌 2.2.原理原理(玻片凝集玻片凝集)将抗体直接与未知抗原物质将抗体直接与未知抗原物质如细菌如细菌混混合，在电解质存在条件下，如两者对应便发生特合，在电解质存在条件下，如两者对应便发生特异性结合而形成肉眼可见的凝集物，即为阳性，异性结合而形成肉眼可见的凝集物，即为阳性，可判断细菌种类。可判断细菌种类。
7、生理盐水生理盐水 志贺诊断血清志贺诊断血清 +待检菌待检菌 待检菌待检菌 2人一个玻片 3.3.实验方法实验方法 混匀 4.本卷须知：本卷须知：1生理盐水、诊断血清要适量；生理盐水、诊断血清要适量；2待检菌为肠道致病菌，注意无菌操作，待检菌为肠道致病菌，注意无菌操作，玻片用后，酒精擦过后，放入消毒缸内；玻片用后，酒精擦过后，放入消毒缸内；3用接种环取待检菌时，不要挑取琼脂；用接种环取待检菌时，不要挑取琼脂；待检菌与生理盐水、诊断血清混匀时，待检菌与生理盐水、诊断血清混匀时，不要涂得太宽，否那么影响结果观察。不要涂得太宽，否那么影响结果观察。3.3.实验方法实验方法 现象现象 结论结论 待检菌待
8、检菌 待检菌待检菌 实验内容实验内容 +生理盐水生理盐水 志贺诊断血清志贺诊断血清 5.5.结果观察与判断结果观察与判断 二、沉淀反响二、沉淀反响 1.1.目的：了解双向琼脂扩散试验的原理和用途目的：了解双向琼脂扩散试验的原理和用途 2.2.根本原理根本原理 可溶性抗原可溶性抗原如血清、毒素、细菌浸出液等如血清、毒素、细菌浸出液等与相应抗体结合，当两者比例适宜、并有适量电与相应抗体结合，当两者比例适宜、并有适量电解质存在时，形成肉眼可见的沉淀物或沉淀线，解质存在时，形成肉眼可见的沉淀物或沉淀线，称为沉淀反响。常用于定性检测，也可用于半定称为沉淀反响。常用于定性检测，也可用于半定量检测。量检测。
9、二、沉淀反响二、沉淀反响 2.2.根本原理根本原理 将抗原与抗体分别参加琼脂凝胶板上相邻近的将抗原与抗体分别参加琼脂凝胶板上相邻近的小孔内，让它们相互向对方扩散。当两者在最适当小孔内，让它们相互向对方扩散。当两者在最适当比例处相遇时，即形成一条清晰的沉淀线。根据有比例处相遇时，即形成一条清晰的沉淀线。根据有否出现沉淀线，可用的抗体鉴定未知的抗原，或用否出现沉淀线，可用的抗体鉴定未知的抗原，或用的抗原鉴定未知的抗体。的抗原鉴定未知的抗体。3.3.材料材料 1 1人血清、兔抗人血清。人血清、兔抗人血清。2 21.5%1.5%琼脂琼脂用生理盐水或巴比妥用生理盐水或巴比妥缓冲液配成缓冲液配成。3 3载
10、玻片、移液枪、水浴锅、玻璃载玻片、移液枪、水浴锅、玻璃管等。管等。二、沉淀反响二、沉淀反响 4.4.方法方法 1)1)制备琼脂玻片：将加热溶化的制备琼脂玻片：将加热溶化的1.5%1.5%琼脂琼脂3.5ml(3.5ml(已制备好已制备好,在水浴锅中在水浴锅中)，迅速倾入载玻片，迅速倾入载玻片上。上。每每2 2人倒一个玻片人倒一个玻片 2)2)打孔：待凝固后用打孔器打孔：待凝固后用打孔器(玻璃管玻璃管)按以下图样按以下图样打孔。打孔。孔径孔径3mm3mm，孔距，孔距4mm4mm每每1 1人打一个梅花人打一个梅花 二、沉淀反响二、沉淀反响 3)3)加样加样 以上方孔为第以上方孔为第1 1孔，按顺时针
11、方向分别称为孔，按顺时针方向分别称为2 2、3 3、4 4、5 5和和6 6孔，中央孔为孔，中央孔为7 7孔。孔。7 7孔参加孔参加1:101:10人血清人血清10 10 l(l(已稀释已稀释好好)，1 1-5 5孔参加对倍稀释的兔抗人血清孔参加对倍稀释的兔抗人血清原液，原液，1:21:2，1:41:4，1:81:8，1:161:16 10 10 l l；6 6孔参加孔参加 生理盐水生理盐水10 10 l l，作为阴性对照孔。作为阴性对照孔。Ab Ab(1:4)Ab(1:8)盐水盐水 人人Ag Ab(1:2)Ab(1:16)1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 每孔加样每孔加样10 l 注意移液枪的使用！注意移液枪的使用！4)4)温育温育 置湿盒置湿盒3737温育温育1212-24 h24 h。4)4)温育温育 置湿盒置湿盒3737温育温育1212-24 h24 h。5.5.结果观察结果观察 以出现明显沉淀线的最高稀释度为该兔抗人以出现明显沉淀线的最高稀释度为该兔抗人血清的效价。血清的效价。记录琼脂玻片双向扩散是否有沉淀线记录琼脂玻片双向扩散是否有沉淀线,分布在分布在哪几档稀释度之间哪几档稀释度之间 并画图。并画图。上交实验报告！上交实验报告！用过的枪头放入用过的枪头放入消毒缸！消毒缸！