1、研究论文胆固醇酯对非酒精性脂肪肝药物治疗的影响朱豆豆1，朱升龙，崔思远，陆旭阳1，陈永泉（1.江南大学无锡医学院，江苏无锡2 1412 2；2.无锡市第二人民医院，江苏无锡2 1412 2）摘要：胆固醇酯(cholesteryl ester,CE)是胆固醇过量时的储存产物。研究表明CE在多种代谢类疾病的诊疗中都扮演着重要角色，然而膳食摄入CE对非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liverdisease,NAFLD)药物治疗的影响仍不清晰。作者以非诺贝特(fenofibrate,Feno)治疗的NAFLD小鼠为模型，通过膳食补充CE研究其对非诺贝特治疗效果的影响。结果表明，
2、非诺贝特可有效缓解NAFLD的症状，而膳食补充CE后削弱了非诺贝特对NAFLD的治疗效果。此外，转录组学以及RT-QPCR分析表明，膳食补充CE可逆转非诺贝特调控的脂肪酸代谢以及胆固醇酯化相关基因Soatl和Soat2mRNA的表达。以上结果表明，膳食添加CE可显著影响NAFLD的药物治疗效果，推测当饮食中CE质量分数较高时，非诺贝特的治疗效果将被降低。该研究为非酒精性脂肪肝患者接受药物治疗期间的合理膳食提供了理论依据。关键词：胆固醇酯；非酒精性脂肪肝：非诺贝特中图分类号：TS 201.4文章编号：16 7 3-16 8 9(2 0 2 3)0 7-0 0 11-0 7 DOl:10.3969
3、/j.issn.1673-1689.2023.07.002Effect of Cholesteryl Ester on Drug Treatment inNon-Alcoholic Fatty Liver DiseaseZHU Doudou,ZHU Shenglong,CUI Siyuan?,LU Xuyang,CHEN Yongquan(1.Wuxi School of Medicine,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;2.Wuxi Second Peoples Hospital,Wuxi 214122,China)Abstract:Cholest
4、eryl ester(CE)is a storage product of excessive cholesterol.Studies have shownthat CE plays an important role in the diagnosis and treatment of various metabolic diseases,but theeffect of dietary CE on drug treatment for non-alcoholic fatty liver disease(NAFLD)is still unclear.Using a NAFLD mouse mo
5、del treated with fenofibrate(Feno),the effect of dietary CEsupplementation on the efficacy of Feno treatment was investigated.Results showed that Fenoeffectively alleviated NAFLD symptoms,but dietary CE supplementation weakened its therapeuticeffect.Furthermore,transcriptomics analysis and RT-QPCR s
6、howed that dietary CE could reverse theexpression of fatty acid metabolism and cholesterol esterification related genes,i.e.,Soatl and Soat2mRNA,regulated by Feno.These results suggest that dietary CE intake significantly impacts the drugtreatment for NAFLD,and it is speculated that the higher intak
7、e of CE may reduce the efficacy ofFeno treatment.This study provides a theoretical basis for the reasonable diet for patients with收稿日期：2 0 2 1-0 6-2 4基金项目：国家自然科学基金项目（317 7 1539，8 2 0 0 0 8 0 8）；国家“食品科学与工程”一流学科建设项目（JUFSTR20180101）；无锡市科技医疗与公共卫生技术创新与应用项目（N20202005）；无锡转化医学重大专项项目（2 0 2 0 ZHZD03）。*通信作者：陈永
8、泉（19 6 1一），男，博士，教授，博士研究生导师，主要从事糖脂代谢与慢性疾病防治研究。E-mail:食品与生物技术学报2 0 2 3年第42 卷第7 期11RESEARCHARTICLEZHU Doudou,et al:Effect of Cholesteryl Ester on Drug Treatment in Non-Alcoholic Fatty Liver DiseaseNAFLDduringdrugtreatment.Keywords:cholesteryl ester,non-alcoholic fatty liver disease,fenofibrate非酒精性脂肪肝(N
9、AFLD)是最常见的肝病之一。研究表明饮食结构与NAFLD的发生与发展以及后期的治疗效果紧密相关 2-4,其中膳食补充胆固醇对肝脏代谢稳态具有至关重要的影响 5,相关流行病学研究表明，膳食摄入胆固醇是导致NAFLD恶化的独立危险因素之一 6-7 。胆固醇（totalcholesterol,TC)可分为游离态胆固醇(free cholesterol,FC)和胆固醇酯（CE），两种形式的胆固醇在机体代谢中保持动态平衡8。关于食物中CE的报道多集中在禽蛋、蟹黄9 以及猪油 0 中,其中每10 0 g鸡蛋蛋黄中胆固醇酯质量为117 140mg,且油酸胆固醇酯最多。摄人两种不同形式的胆固醇对NAFLD发
10、展以及肝脏内脂质代谢稳态的影响可能存在质的不同，这可能是由于两者结构 2-13 以及合成吸收的途径不同所导致。在细胞内，CE由胆固醇酰基转移酶(SOAT)酯化而成，而FC则主要由乙酰辅酶A在3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGCR）和角鲨烯单加氧酶的作用下于内质网膜中合成8 。FC可由尼曼-匹克C1型类似蛋白1(NPC1L1)直接介导吸收 4,而CE在吸收前需要被胰胆固醇酯酶水解 15。目前关于NAFLD的研究多侧重于FCl,关于CE的研究相对较少。近年来多项研究表明CE可影响多种疾病的诊疗，例如阿尔茨海默病和前列腺癌等 17-19 ,然而CE是否影响NAFLD的治疗，目前尚不清晰。非
11、诺贝特(fenofibrate,Feno)是临床上广泛用于治疗NAFLD的药物，在一项包括16 例经活检证实为NAFLD患者的研究中,使用非诺贝特(2 0 0 mg/d)48 周可显著改善患者的胰岛素敏感性和血脂水平 2 0 。因此,作者采用非诺贝特治疗的NAFLD小鼠模型，探究膳食补充CE对NAFLD药物治疗的影响及其潜在机制。材料与方法1.1材料与仪器1.1.1材料与试剂苏木精-伊红染液试剂盒、油红染色液：南通雨露生物公司产品；胰岛素：通化东宝药业股份有限公司产品；小鼠谷丙转氨酶与甘油三酯测试试剂盒：南京建成生物公司产品;RNA提12JOURNAL OF FOOD SCIENCE AND
12、BIOTECHNOLOGY Vol.42 IsSue 7 2023取试剂盒、SYBR混合物、HiFiPCR混合物：北京康为世纪生物科技有限公司产品；反转录试剂盒：Takara公司产品；第二链cDNA合成试剂盒：碧云天生物公司产品；凝胶回收试剂盒：南京诺唯赞生物科技股份有限公司产品。非诺贝特（使用生理盐水配制，振荡器充分涡旋混匀）：美国雅培制药有限公司产品；CE：T CI 公司产品；高脂饲料（脂肪质量分数6 0%，美国营养学会AIN-93标准）：南通特洛菲饲料科技有限公司产品。6 0%高脂饲料+1%CE饲料（均为质量分数）由南通特洛菲饲料科技有限公司制备，并经6 0 Co辐照灭菌,所有饲料储存于
13、4,使用前取出恢复至室温。1.1.2主要仪器设备石蜡包埋机、全自动轮转式切片机、冰冻切片机：德国Leica公司产品；QP2010Ultra型气相色谱质谱联用仪：日本岛津公司产品；VanquishQExactivePlus型超高效液相色谱、酶标仪：美国Thermo公司产品。1.2实验方法1.2.1实验动物模型建立动物实验方案及所有程序经江南大学动物伦理委员会批准（批准协议号：JN.No20190330c070071036)。从SPF(北京)生物技术有限公司（中国)购买6 周龄的雄性C57BL/6J小鼠,适应实验室条件1周。1)高脂或正常饲料喂养小鼠13周以建立NAFLD小鼠模型。将19 只小鼠分
14、为正常饮食组（normaldiet,ND,n=5）高脂饮食组（high fat diet,HFD,n=7）以及非诺贝特治疗组(HFD-Feno,100mg/kg,n=7),药物治疗组小鼠隔天经灌胃给药,HFD组小鼠给予生理盐水作为对照，持续10 周。2)使用6 周龄的雄性C57BL/6J小鼠，高脂饲料喂养13周以建立NAFLD小鼠模型。将2 1只小鼠分为高脂饮食组（HFD,n=7）、非诺贝特治疗组(HFD-Feno,100 mg/kg,n=7)以及补充质量分数1%CE的非诺贝特治疗组(HFD-CE-Feno,n=7)。药物治疗组小鼠隔天经灌胃给药,HFD组小鼠给予生理盐水作为对照，持续10 周
15、。1.2.2组织病理学检查苏木精-伊红染色参照之前方法 2 1。对于油红染色,将储存在-8 0 冰箱的组织切成8 m厚的切片，并用质量分数4%甲醛固定30min。然后使用油红染色试剂盒对切片进行染色。研究论文朱豆豆，等：胆固醇酯对非酒精性脂肪肝药物治疗的影响1.2.3总胆固醇酯与胆固醇酯种类的测定气相色谱-质谱法(GC-MS)用于检测TC、FC 以及CE质量分数。样品制备步骤如下：2 0 mg肝脏组织于50 0L纯水中匀浆,取10 0 L匀浆液或2 5L血清置于10 mL塑料离心管。同一样品做6 个平行样，分为两组（TC组标记为A1、A 2、A 3;FC组标记为B1、B2、B3)。A 组样品加
16、人1mL1mol/L氢氧化钾-乙醇溶液检测TC,涡旋15s,70金属浴1h。B组加人1 mL乙醇测定FC,充分涡旋。两组后续处理如下：分别向上述混合液中添加1mL超纯水、3mL正已烷，充分涡旋15s,2000r/min离心10 min,分层。转移上清液到新的塑料离心管中,向原管剩余液体中加入3mL正已烷,重复提取一次，混匀。吸取1mL上清液转移至1.5mLEP管，用氮气吹干。向干燥的EP管中添加50 LBSTFA混匀并在7 5金属浴1h，进行衍生化。离心,取40L混合液体至棕色气相瓶，上机或储存在-8 0 冰箱。1.2.4，转录组学分析对于文库的制备，使用UltrapureRNA试剂盒提取总R
17、NA。此外使用RT试剂盒合成具有1g总RNA的cDNA。使用第二链cDNA合成试剂盒合成第二链cDNA。使用凝胶回收试剂盒纯化文库片段。使用HiFiPCR混合物扩增混合物，回收目标产物并进行PCR。使用Qubit?3.0中的QubitRNA分析试剂盒测量文库中的RNA浓度以进行初步定量，然后将其稀释至1ng/L。使用AgilentBioanalyzer2100系统评估插入物的大小，并使用StepOnePlusTM实时PCR系统（库中有效浓度 10 nmol/L),将合格的插人物进行准确定量。使用HiSeq PE Cluster Kit v4-cBot-HS(Illumina）在cBot群集生成
18、系统上对索引编码的样本进行群集。产生簇后，在Illumina平台上对文库进行测序,并产生150 bp的配对末端读段。1.2.5实时荧光定量PCR使用反转录试剂盒从1g总RNA中合成cDNA，使用UltraSYBR混合物进行实时荧光定量PCR(RT-QPCR）。根据3个独立实验样品的阈值循环值分析数据。引物见表1。1.3统计分析使用SPSS25.0版进行数据的正态性和方差齐性分析。所有数据均使用GraphPad Prism7进行分析，数据表示为平均值标准差。两组间比较时，如果数据满足正态性、独立性且方差齐性，则统计检表1qPCR引物序列Table 1qPCR primer sequence基因F
19、:GGTTCATCCTGCCAGAGACTAAtp5bR:AATCCCTCATCGAACTGGACGF:CCAAATCTCCACGGTCTGTTCCycsR:ATCAGGGTATCCTCTCCCCAGF:AGAGCCCCATCTGTCCTCTCPparR:ACTGGTAGTCTGCAAAACCAAAF:CTCCGCCTGAGCCATGAAGCptlaR:CACCAGTGATGATGCCATTCTF:GGAGGTGGTGATAGCCGGTATFasnR:TGGGTAATCCATAGAGCCCAGF:GCGCTACTTCCGAGACTACTTDgat2R:GGGCCTTATGCCAGGAAACTF
20、:GATGAACCATCTCCGTTGGCAcclR:GACCCAATTATGAATCGGGAGTGF:GAAACCGGCTGTCAAAATCTGGSoatlR:TGTGACCATTTCTGTATGTGTCCF:ACAAGACAGACCTCTTCCCTCSoat2R:ATGGTTCGGAAATGTTGCACCF:AGATCAAGATCATTGCTCCTCCTActbR:ACGCAGCTCAGTAACAGTCC验方法选用独立样本t检验；两组以上数据比较采用单因素方差分析,P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1非诺贝特治疗NAFLD的效果分析高脂饮食饲喂13周以建立NAFLD小鼠模型，连续10
21、 周隔天灌胃给药后，观测药物疗效。与HFD组相比,非诺贝特在不影响小鼠肝脏质量和白色脂肪质量的同时显著降低体质量。此外，治疗期间的小鼠进食量无显著差异（见图1)。55NDHFD.HFD-Feno50453/403530250食品与生物技术学报2 0 2 3年第42 卷第7 期引物序列24时间/周（a）小鼠体质量681013RESEARCHARTICLEZHU Doudou,et al:Effect of Cholesteryl Ester on Drug Treatment in Non-Alcoholic Fatty Liver DiseaseCE的调控作用。其中,胆固醇油酸酯是小鼠肝脏中4
22、3210HFDHFD-Feno(b）小鼠食物摄入量图1非诺贝特对小鼠体质量以及组织质量的影响Fig.1 Effect of fenofibrate on the body weight and tissueweight of mice从图2(a)、2(b)可知,同HFD组小鼠相比,非诺贝特可以显著降低小鼠肝脏内甘油三酯(triglycerides,TG）和谷丙转氨酶（alanine amino-transferase,ALT)水平。图2(c)是染色后的肝脏石蜡切片与冰冻切片，与ND组相比,HFD组小鼠肝脏存在明显的脂质堆积。同HFD组小鼠相比,HFD-Feno组小鼠肝脏的脂质堆积情况得到显著改
23、善。0.6b0.4a0.20NDHFDHFD-Feno(a)肝脏TG水平50um320NLHFDHFD-Feno(c)小鼠肝脏质量3(8/D)/XITVI2aa0HFDHFD-Feno(b)肝脏ATL水平50mb4b320NDHFDHFD-Feno（d）白色脂肪质量bCE增加的主要形式。bb50um25(8/u)/O班20151050-FenoHFD-HFD-CE-Feno(a）小鼠肝脏CE水平（b）小鼠肝脏中胆固醇油酸酯丰度图3膳食补充CE对小鼠肝脏胆固醇酯水平的影响Fig.3Effects of dietary CE on hepatic cholesterol levelsof mice
24、2.3膳食补充CE对非诺贝特药效的影响如图4所示,非诺贝特治疗10 周后,与HFD-Feno组相比,膳食补充CE在不影响体质量与白色脂肪质量的同时可增加小鼠肝脏质量。但与HFD-Feno 组小鼠相比,HFD-CE-Feno 组小鼠的血糖水平没有显著改变。60abb3/唐里40200HFDHFD-FHFD-CE-Feno(a）小鼠体质量3a3/23107b2107a1107a0HFDHFD-FenoHFD-CE-Feno43ab20S.FenoHFD-FHIFD-CE-FenO(b）小鼠肝脏质量10(T/ouru)/baba50MmND图2 非诺贝特对小鼠肝脏的影响Fig.2 Effect of
25、 fenofibrate on the liver of mice2.2膳食补充CE对小鼠肝脏中CE的影响非诺贝特能够有效缓解NAFLD的症状，在膳食补充CE后，药物治疗组小鼠肝脏内的胆固醇质量分数发生明显改变。如图3所示，相较于HFD组，非诺贝特显著降低了小鼠肝脏中的CE水平，但膳食添加CE抵消了非诺贝特对NAFLD小鼠肝脏中5mHFD(c）小鼠肝脏切片500mHFD-FenoHFDHFD-FHFD-FenoHFD-CE-Feno(c）白色脂肪质量(d)血糖水平图4膳食补充CE对小鼠组织质量及血糖水平的影响Fig.4Effects of dietary CE on tissue weight
26、 and bloodglucose level of mice从图5(a)可知,HFD-CE-Feno组小鼠肝脏中TG水平并未显著增加,但具有升高的趋势。小鼠肝脏的石蜡切片与冰冻切片染色结果也一致表明,膳食补充CE可削弱非诺贝特对NAFLD小鼠的治疗效果(见图 5(b)。14JOURNAL OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY Vol.42 IsSue 7 2023研究论文朱豆豆，等：胆固醇酯对非酒精性脂肪肝药物治疗的影响0.80.60.40.20HFDHFD-FenoHFD-CE-Feno(a)肝脏TG水平100um100um50m50umNDHFD(b）小鼠肝
27、脏切片图5膳食补充CE对非诺贝特治疗小鼠肝脏的影响Fig.5Effect of dietary CE on the liver of mice treatedwith fenofibrate2.4补充CE对非诺贝特治疗的NAFLD小鼠肝脏脂质相关基因转录组水平的影响如图6(a)所示,非诺贝特调控基因中倍数改变前2 0 的基因聚类显示,在补充CE后,非诺贝特调控的基因呈现相反的变化。从图6(b)可知,非诺贝特上调的151个基因中，有7 8 个基因在膳食补充CE后下调；而在非诺贝特下调的16 7 个基因中,有75个发生上调。为进一步探究这些差异基因所参与的代谢途径，分别对两组差异基因进行GO富集分
28、析。如图7(a)所示,非诺贝特主要影响甘油三酯代谢、脂肪酸的氧化以及PPAR信号通路，尤其是胆固醇酯化途径。而在HFD-CE-Feno组,补充CE主要影响甘油三酯代谢以及蛋白质人核(见图7(b)。从图8 可知，在高脂饮食情况下，非诺贝特显著升高氧化磷酸化相关基因Atp5b以及Cycs在肝脏中的mRNA水平,而在HFD-CE-Feno组,两者均显著降低。同HFD组相比，非诺贝特显著升高Ppar以及Cptla的mRNA水平,而CE则逆转了非诺贝特对该基因的调控作用。尽管CE并未影响Fasn以及Accl的表达，但补充CE后,Dgat2的mRNA水平呈倍数增加,具有明显上升趋势。此外，非诺贝特显著降低
29、胆固醇酯化基因Soatl与Soat2的表达,膳食补充CE抵消了非诺贝特的影响。由此aaaZnrf1RrbplKlhdc10F5Npr2Slc27a2ligplCcar!Rbm5Mfsd2aEvi5Serping!Ppplri2aTmbim6Lims2Srsf5Gstp1LcatEcilUgp2Dhx15Ze3hiaChp!Gsk3aArhgef12Ubr2U2surplygup2100.umRexolKIf6Gbp4UqcrgNme2Rab5cCskSaa4.50MmAspdhPrdx1HFD-CE-FenoStardioHFD-FenoHFD-CE-Feno（a）肝脏RNA-scq分析中前2
30、 0 个变化较大基因的热图73非诺贝特上调的基因92非诺贝特下调的基因（b）差异基因分析图图6膳食补充CE对脂质相关基因表达的影响Fig.6Effect of dietary CE on lipid-related geneexpressioncholesterol esterification|-HFD-Fenotriglyceride homeostasispositive regulation of lipid catabolic processfstty acid beta-oxidationPPAR signaling pathwaytriglyceridemetabolic pro
31、cesslipid oxidation（a）补充CE前小鼠肝脏的GO分析negative regulation of protein import into nucleus p HFD-CE-FenoPlasma lipoprotein assemblynegative regulation of protein localization to nucleustriglyceride biosynthetic processdetoxification(b）补充CE后小鼠肝脏的GO分析图7 膳食补充CE对脂质相关通路的影响Fig.7 Effect of dietary CE on lipid-
32、related pathways食品5生物技术学报2 0 2 3年第42 卷第7 期152.001.501.000.500.00-0.50-1.00-1.50胆固醇酯下调的基因7827胆固醇酯上调的基因75310.080.12.0.16.0.200.24富集比值数目4.68100.080.120.160.200.24富集比值q的对数值-2-3-4-5RESEARCHARTICLEZHU Doudou,et al:Effect of Cholesteryl Ester on Drug Treatment in Non-Alcoholic Fatty Liver DiseaseHFD感性和葡萄糖代
33、谢的影响而言,结果喜忧参半 32-3。在该研究中，膳食补充CE在增加小鼠肝脏中CE6HFD-CE-FcnOHFD-F-Fen一0Fig.8 Changes in the expression of lipid-related pathwaygenes可以推测，补充CE改变了非诺贝特对脂肪酸代谢以及胆固醇酯化的调控作用。先前研究表明，肥胖与血液中CE水平显著相关，肥胖受试者肝脏中CE的水平相比于对照组增加了3倍 2 2 。成像数据显示在重症前列腺癌和转移的脂滴中存在酯化胆固醇的积累 18。此外,CE影响动脉粥样硬化 2 3-2 4、乳腺癌 2 5、白血病 2 6 和神经胶质瘤 2 7 等多种疾病
34、,这表明CE也可能在疾病发展中起关键作用。NAFLD的发生通常与肝脏中甘油三酯的升高有关 2 8 ,然而,最近的研究表明胆固醇稳态在NAFLD中起着核心作用 2 。作为临床常用于治疗NAFLD的药物，非诺贝特与TG和高密度脂蛋白胆固醇水平的改善紧密相关 30-31。然而,就非诺贝特对胰岛素敏参考文献：1 J YOUNOSSI Z M.Non-alcoholic fatty liver disease-a global public health perspectiveJ.Journal of Hepatology,2019,70(3):531-544.2 SALEHI-SAHLABADI A,
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39、l and cholesteryl esters of eggs from various avian speciesJJ.Poultry Science,1980,59(9):abAtpsbCycs氧化磷酸化图8 脂质相关通路基因的表达变化的同时削弱了非诺贝特对NAFLD小鼠的治疗效果。因此猜测非诺贝特临床治疗效果差异显著的一个潜在原因可能是患者肝脏中CE的水平不同,这PparaCptla脂肪酸氧化FasnDgat2脂肪生成AcclSoat1胆固醇酯化Soat 2可能是饮食中过量摄人CE导致的。此外，干预生活方式仍是目前治疗NAFLD的重要手段，通过控制饮食减轻体质量可显著减少肝脂肪变性和炎
40、症 34。因此合理适量的调整饮食，即减少非诺贝特治疗的NAFLD患者饮食中CE的摄人或可进一步改善药物的治疗效果。然而,CE如何介人非诺贝特治疗NAFLD的具体机制仍需进一步研究。3结语膳食补充CE会增加小鼠肝脏中CE水平,在不影响体质量的同时抵消非诺贝特治疗小鼠NAFLD的效果。此外CE影响了甘油三酯代谢以及蛋白质入核过程，同时逆转了非诺贝特对氧化磷酸化、脂肪酸氧化以及脂质生成相关基因表达的调节作用。尽管NAFLD对人体健康造成很大影响，但治疗疾病可选择的方案仍然有限。因此,开发与CE相关的治疗NAFLD的手段以及探究如何通过膳食指导提高药物疗效应引起关注。16JOURNAL OF FOOD
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