1、流式细胞凋亡分析流式细胞凋亡分析 概概 念念 细胞凋亡细胞凋亡apoptosisapoptosis是指有核细是指有核细胞在一定条件下通过启动其内部自身机制，胞在一定条件下通过启动其内部自身机制，主要是通过内源性主要是通过内源性DNADNA内切酶的激活而发内切酶的激活而发生的细胞死亡过程。细胞凋亡是受基因控生的细胞死亡过程。细胞凋亡是受基因控制的一种主动性细胞自杀过程，是生物体制的一种主动性细胞自杀过程，是生物体中一种普遍存在的现象。中一种普遍存在的现象。概概 念念 细胞凋亡是维持人体正常生理过程和细胞凋亡是维持人体正常生理过程和功能活动所必需的，是多细胞生物生命活功能活动所必需的，是多细胞生物
2、生命活动过程中不可缺少的组成内容，是其藉以动过程中不可缺少的组成内容，是其藉以存活的需要，贯穿了生物全部生命周期中。存活的需要，贯穿了生物全部生命周期中。概概 念念 细胞凋亡与细胞坏死细胞凋亡与细胞坏死necrosisnecrosis是是细胞死亡的两种模式，但两者有明显的区细胞死亡的两种模式，但两者有明显的区别。后者是由于细胞受到严重损伤或或大别。后者是由于细胞受到严重损伤或或大剂量细胞毒药物作用后发生的被动分解过剂量细胞毒药物作用后发生的被动分解过程，并可导致周围组织的炎症反响。程，并可导致周围组织的炎症反响。概概 念念 细胞凋亡的作用主要包括以下几方面：细胞凋亡的作用主要包括以下几方面：去
3、除无功能的细胞；去除无功能的细胞；控制细胞数量；控制细胞数量；去除病态的或有害的细胞；去除病态的或有害的细胞；去除多余的细胞；去除多余的细胞；细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征 形态学特征：形态学特征：光镜下，凋亡细胞最突出的形态学特光镜下，凋亡细胞最突出的形态学特征是细胞核固缩、染色质浓集、细胞变圆征是细胞核固缩、染色质浓集、细胞变圆皱缩而细胞膜保持完整，其中胞核变化尤皱缩而细胞膜保持完整，其中胞核变化尤为突出。染色质的浓集可能是由于凋亡细为突出。染色质的浓集可能是由于凋亡细胞核双链胞核双链DNADNA发生裂解所致。发生裂解所致。细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征 形态学特征：形态学特征：DNADNA降
4、解后，形成长度主要为降解后，形成长度主要为180180-200bp200bp的的DNADNA片断，随后细胞裂解成许多有片断，随后细胞裂解成许多有膜包被的小体，称为凋亡小体膜包被的小体，称为凋亡小体apoptotic apoptotic bodies),bodies),最后被巨噬细胞吞噬，但不会引最后被巨噬细胞吞噬，但不会引起周围组织的炎症反响。凋亡小体是凋亡起周围组织的炎症反响。凋亡小体是凋亡细胞特征性的标志。如在显微镜下观察到细胞特征性的标志。如在显微镜下观察到凋亡小体，那么可确认为细胞发生了凋亡。凋亡小体，那么可确认为细胞发生了凋亡。细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征 形态学特征：形态学特征：电
5、镜下，细胞核内可见高电子密度区，电镜下，细胞核内可见高电子密度区，这是核这是核DNADNA在核小体连接处断裂成核小体后，在核小体连接处断裂成核小体后，在异染色质区聚集形成的染色质浓缩块。在异染色质区聚集形成的染色质浓缩块。染色质聚集区以外的低电子密度区为透明染色质聚集区以外的低电子密度区为透明区，是由于核孔变大导致其通透性增加，区，是由于核孔变大导致其通透性增加，细胞质中水分不断渗入而造成。线粒体增细胞质中水分不断渗入而造成。线粒体增殖，呈空泡化。内质网腔扩大，为凋亡细殖，呈空泡化。内质网腔扩大，为凋亡细胞形成自噬体提供包裹膜。细胞骨架变得胞形成自噬体提供包裹膜。细胞骨架变得致密、紊乱。致密、
6、紊乱。细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征 形态学特征：形态学特征：细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征 形态学特征：形态学特征：细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征 形态学特征：形态学特征：共聚焦显微镜观察，凋亡细胞膜电位共聚焦显微镜观察，凋亡细胞膜电位和线粒体膜电位下降，膜流动性降低。细和线粒体膜电位下降，膜流动性降低。细胞膜上新出现了一些生物大分子如磷脂酰胞膜上新出现了一些生物大分子如磷脂酰丝氨酸丝氨酸phosphatidylserine,ps)phosphatidylserine,ps)和凝血和凝血酶敏感蛋白等，这些分子的出现与凋亡细酶敏感蛋白等，这些分子的出现与凋亡细胞的去除有关。胞的去除有关。细胞凋亡的特
7、征细胞凋亡的特征 形态学特征：形态学特征：凋亡细胞另一个形态特征通过总凋亡细胞另一个形态特征通过总DNADNA提提取，取，DNADNA凝胶电泳分析，可呈现出梯状图谱，凝胶电泳分析，可呈现出梯状图谱，可见清晰的可见清晰的DNADNA梯子梯子(ladder)(ladder)。细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征 生化特征：生化特征：1 caspase1 caspase蛋白酶：蛋白酶：细胞凋亡的发生和开展过程也可能是细胞凋亡的发生和开展过程也可能是水解酶级联切割的过程，它将大分子结构水解酶级联切割的过程，它将大分子结构的物质如的物质如DNADNA、细胞骨架水解变性成小分子、细胞骨架水解变性成小分子碎片，致使
8、细胞发生凋亡。碎片，致使细胞发生凋亡。细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征 生化特征：生化特征：1 caspase1 caspase蛋白酶：蛋白酶：其中，半胱氨酸蛋白酶家族发挥了重其中，半胱氨酸蛋白酶家族发挥了重要作用。它具有一段携带活化位点的保守要作用。它具有一段携带活化位点的保守氨基酸序列，可以特异性识别、切割天冬氨基酸序列，可以特异性识别、切割天冬氨酸转氨甲酰酶残基。由于这些蛋白酶具氨酸转氨甲酰酶残基。由于这些蛋白酶具有相同的结构和功能特性而被称为有相同的结构和功能特性而被称为caspasecaspase。细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征 生化特征：生化特征：1 caspase1 caspase蛋白
9、酶：蛋白酶：caspasecaspase可能在凋亡细胞的形态变化中可能在凋亡细胞的形态变化中起了主导作用。起了主导作用。CaspaseCaspase通常是以酶原形式通常是以酶原形式存在，通过其自身诱发的蛋白水解而转化存在，通过其自身诱发的蛋白水解而转化为有活性的酶，活化的为有活性的酶，活化的caspasecaspase进一步激活进一步激活其他的其他的caspasecaspase前体，形成了级联放大切割前体，形成了级联放大切割过程，裂解重要的大分子物质，导致凋亡。过程，裂解重要的大分子物质，导致凋亡。细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征 生化特征：生化特征：1 caspase1 caspase蛋白酶：蛋
10、白酶：目前已发现目前已发现1515个个caspasecaspase家族成员，分家族成员，分别命名为别命名为caspasecaspase-1 11515，并根据其功能特，并根据其功能特点分成两类，即启动点分成两类，即启动caspase(caspasecaspase(caspase-2 2、8 8、9 9、1010和效应和效应caspase(caspase3caspase(caspase3、6 6、7 7。细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征 生化特征：生化特征：1 caspase1 caspase蛋白酶：蛋白酶：启动启动caspasecaspase作用于凋亡信号触发后上作用于凋亡信号触发后上游的不可逆位
11、点。效应游的不可逆位点。效应caspasecaspase由启动胱冬由启动胱冬肽酶激活，作用于下游的执行位点，裂解肽酶激活，作用于下游的执行位点，裂解细胞成凋亡小体。分子结构相互联系的这细胞成凋亡小体。分子结构相互联系的这两局部影响线粒体，通过线粒体方式执行两局部影响线粒体，通过线粒体方式执行凋亡的信号。凋亡的信号。bclbcl-2 2家族成员能调节执行位家族成员能调节执行位点的进程。点的进程。细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征 生化特征：生化特征：1 caspase1 caspase蛋白酶：蛋白酶：caspasecaspase-3 3是最重要的指示蛋白酶，为是最重要的指示蛋白酶，为17kD17kD和
12、和12kD12kD亚单位组成的异二聚体。活化亚单位组成的异二聚体。活化的的caspasecaspase-3 3可以蛋白水解切割和激活其他可以蛋白水解切割和激活其他caspasecaspase、相关的胞质靶位点、相关的胞质靶位点细胞因子细胞因子1818，CK18)CK18)和细胞核靶位点。和细胞核靶位点。CaspaseCaspase-3 3切割切割CK18CK18是凋亡过程中是凋亡过程中caspasecaspase切割发生的早期切割发生的早期指示因子。指示因子。细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征 生化特征：生化特征：2 2 核酸内切酶的激活：核酸内切酶的激活：细胞凋亡时，内源性核酸内切酶被激细胞凋亡时
13、，内源性核酸内切酶被激活，将核小体间连接活，将核小体间连接DNADNA降解，形成长度主降解，形成长度主要为要为180180-200bp200bp整数倍的寡核苷酸片段，组整数倍的寡核苷酸片段，组蛋白和其他核内蛋白质不降解，核基质也蛋白和其他核内蛋白质不降解，核基质也不改变。在不改变。在DNADNA凝胶电泳分析中呈现出特征凝胶电泳分析中呈现出特征性性“梯状梯状条带，而细胞坏死时，条带，而细胞坏死时，DNADNA片断片断大小不一，无大小不一，无“梯状梯状条带出现。但并非条带出现。但并非所有凋亡细胞都能检测到这种典型的生化所有凋亡细胞都能检测到这种典型的生化特征。特征。细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征 生
14、化特征：生化特征：2 2 核酸内切酶的激活：核酸内切酶的激活：细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征 生化特征：生化特征：3 3 线粒体的变化：线粒体的变化：线粒体发生的重要改变之一就是凋亡线粒体发生的重要改变之一就是凋亡诱导因子使线粒体通透性升高，膜上巨型诱导因子使线粒体通透性升高，膜上巨型通道开放，使线粒体蛋白进入细胞液中，通道开放，使线粒体蛋白进入细胞液中，线粒体膜两侧质子不对称性消失，线粒体线粒体膜两侧质子不对称性消失，线粒体膜电位迅速下降，电子传递与呼吸链解偶膜电位迅速下降，电子传递与呼吸链解偶联。联。细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征 生化特征：生化特征：3 3 线粒体的变化：线粒体的变化：线粒体
15、膜电位的变化发生在细胞凋亡线粒体膜电位的变化发生在细胞凋亡的早期。线粒体膜电位是由于其内膜两侧的早期。线粒体膜电位是由于其内膜两侧质子和其他离子分布不对称造成的。线粒质子和其他离子分布不对称造成的。线粒体参与了凋亡的调控和实施。与凋亡密切体参与了凋亡的调控和实施。与凋亡密切相关的相关的bclbcl-2 2家族分布在细胞内膜系统，其家族分布在细胞内膜系统，其中线粒体外膜上分布最多，中线粒体外膜上分布最多，bclbcl-2 2具有抑制具有抑制线粒体通透性变化的能力，并通过此途径线粒体通透性变化的能力，并通过此途径抑制细胞凋亡。抑制细胞凋亡。细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征 生化特征：生化特征：4 4
16、胞质胞质CaCa2+2+和和pHpH的变化：的变化：细胞内细胞内CaCa2+2+和和H H+浓度的稳定对维持生命浓度的稳定对维持生命活动至关重要。胞内活动至关重要。胞内CaCa2+2+库的释放，胞质库的释放，胞质CaCa2+2+与细胞凋亡关系密切。胞外与细胞凋亡关系密切。胞外CaCa2+2+内流促内流促使胞质使胞质CaCa2+2+持续升高，作为凋亡信号启动凋持续升高，作为凋亡信号启动凋亡发生。亡发生。细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征 生化特征：生化特征：4 4 胞质胞质CaCa2+2+和和pHpH的变化：的变化：此外，此外，CaCa2+2+的释放打破了细胞内结构的的释放打破了细胞内结构的稳定，使得细胞凋亡效应系统的关键成分稳定，使得细胞凋亡效应系统的关键成分开始和细胞结构正常时不能接触到的基质开始和细胞结构正常时不能接触到的基质接触，从而触发细胞凋亡。接触，从而触发细胞凋亡。细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征 生化特征：生化特征：4 4 胞质胞质CaCa2+2+和和pHpH的变化：的变化：细胞细胞pHpH的变化可影响细胞凋亡。细胞的变化可影响细胞凋亡。细胞凋亡时伴随胞质凋亡时伴随胞质pHpH降低