1、实验研究 和高脂暴露对小鼠脑组织氨基酸类神经递质、神经元的影响郑刘根，单姗，程东，李慧，姚文环，赵秀兰，张天亮（通信作者）山东大学公共卫生学院毒理与营养学系，山东 济南 ；山东省疾病预防控制中心卫生检验检测所；山东省疾病预防控制中心基金项目：国家自然科学基金资助项目（，）；山东省重点研发计划（重大科技创新工程）项目（）作者简介：郑刘根（），男，硕士，研究方向：卫生毒理学通信作者：张天亮，：摘要：目的观察长期低剂量邻苯二甲酸二（乙基己基）酯（），暴露及高脂喂养对小鼠脑组织氨基酸类神经递质和神经元的影响。方法选择体质量 级雌性 小鼠，适应性喂养周，随机分为对照组（组）、组（组）、高脂组（组）、暴露
2、联合 喂养组（组）。组和 组小鼠经口给予 ，组、组小鼠给予等体积溶剂，组、小鼠喂饲普通维持饲料，组、组小鼠喂饲高脂饲料。第 周末，每组随机取只小鼠脱臼处死，取脑组织制备匀浆，并采用高效液相色谱法检测脑组织氨基酸类神经递质水平；每组剩余只小鼠经体内灌注固定，制备大脑冰冻切片，采用尼氏染色观察神经元的变化。结果 组大脑皮层 高于 组、组，组、组 低于 组（）；各组其他指标比较差异无统计学意义（）。各组中脑中氨基酸类神经递质水平比较差异无统计学意义（）。组、组、组小脑 均高于 组，组 高于 组、组、组（）；各组其他指标比较差异无统计学意义（）。与 组相比，组、组及 组小鼠大脑神经元中尼氏体颜色变淡、
3、着色颗粒稀疏，以 组最为明显。结论 长期暴露和高脂饮食可破坏小鼠脑内氨基酸类神经递质的内稳态，导致神经元损伤。关键词：邻苯二甲酸二乙基己酯；高脂饮食；氨基酸类神经递质；神经毒性；脑组织 ：中图分类号：文献标识码：文章编号：（），；，；：（）（）（）（），（），（），（），（），（），（）；（），（），预防医学论坛 年月第 卷第期 ，（）；（），：；邻苯二甲酸酯（，）是目前使用最多的增塑剂，广泛应用于装修材料、儿童玩具、化妆品、食品包装及医疗用品中，其中，邻苯二甲酸二乙基己酯（），的使用量约占 的 。极易从塑料母体释放到环境中，可通过呼吸道、消化道和皮肤进入人体。研究显示，一般人群平均每日 摄入
4、量为 ，我国规定 的可耐受每日摄入量为 ，人类母乳、血液和尿液中均可检测到 及代谢产物。流行病学研究显示，儿童尿液 及其代谢产物水平 与智力评分 及认知功能呈 负相关。采用秀丽线虫的研究显示，早期慢性 暴露可加重秀丽线虫因衰老导致的长期记忆下降。连续个月通过饲料给予 大鼠 的 ，可导致大鼠的空间学习记忆受损。雌性小鼠孕期经口暴露 的 ，其子代小鼠表现出情绪焦虑、空间和识别记忆下降等行为学改变，伴随海马椎体神经元变性。这些研究提示 可能具有神经毒性，但机制尚不明确。研究显示，一些环境污染物通过影响脑内兴奋性和抑制性氨基酸类神经递质水平及其稳态引起神经系统损伤。兴奋性氨基酸类神经递质主要包括谷氨酸
5、（，）、天冬氨酸（，）、抑制性氨基酸类神经递质包括氨基丁酸（，）、甘氨酸（，）。牛磺酸（，）在大脑中广泛存在且对大脑具有重要的保护作用。大脑内兴奋性和抑制性神经递质间的平衡状态决定了神经元的兴奋性，神经递质内稳态失衡与神经退行性病变、脑损伤和认知功能损伤密切相关。目前研究显示，高脂饮食与 肥 胖 也 被 证 明 与 中 枢 神 经 功 能 障 碍 密 切 相关 。已知饮食是机体内 的主要来源，日常生活中 暴露和高脂饮食多同时存在。本实验采用 雌性小鼠，分别给予普通饲料和高脂饲料喂养，同时连续 周经灌胃给予 。部分动物脱臼处死后迅速分离脑组织，采用高效液相色谱法（，）检测脑内种氨基酸酸类神经递质
6、水平，部分动物经体内灌注固定，制备冰冻切片，经尼氏染色观察脑组织神经元的变化，探索 神经毒性的潜在机制。材料与方法 动物、试剂及仪器 级雌性 小鼠 只，体质量 ，购自北京华阜康生物科技有限公司，动物生产许可证号为 （京）。普通维持饲料（，脂肪供能比）和高脂饲料（，脂肪供能）均购自美国 公司。实验动物饲养于屏障环境，实验动物使用许可证号 为 （鲁）号，环 境 温 度（），环境相对湿度（），明暗循环 ，可自由进食及饮水，适应性喂养。本实验研究符合 美 国 国 立 卫 生 研 究 院（，）实验动物使用的伦理和福利要求，实验方案经过山东大学公共卫生伦理学委员会审批（审批号 ）。色谱纯甲醇和乙腈购自上海
7、国药集团化学试剂有限公司，天冬氨酸（）、谷氨酸（）、甘氨酸（）、氨基丁酸（）和牛磺酸（）标准品购自北京索莱宝科技有限公司，所有其他化学试剂均为市售分析纯以上。型高效液相色谱仪及 （，）色谱柱（日本岛津株式会社），生物样品匀浆仪（杭州奥盛仪器有限公司），数字切片扫描仪 （匈牙利 公司）。动物分组及处理随机分为对照组（组）、组（组）、高脂组（组）、暴露联合 喂养组（组），各 只。组、组每日经口给予玉米油稀释的，剂量为 、体积 。组、组给予等体积玉米油灌胃。组、组喂饲普通维持饲料，组、组喂饲高脂饲料。连续 周。观察指标 脑组织中种氨基酸类神经递质水平检测采用 对脑组织中 、和 进行测定。检测条件如表
8、。流动相为 的醋酸钠缓冲溶液（值为 ）与体积分数 的乙腈溶液，具体梯度洗脱程序如表。预防医学论坛 年月第 卷第期 ，表 检测条件参数数值参数数值检测器光电二极阵列管检测器流量 柱温 进样量 色谱柱 检测波长 表梯度洗脱程序时间（）醋酸钠缓冲液（）乙腈溶液（）标准曲线制备：配制分别含有、和 的混合标准系列溶液，取以上混合标准系列溶液 ，分别与 的碳酸氢钠溶液和 的，二硝基氟苯（，）溶液充分混合，暗反应 。反应后按照上述检测条件进行检测，分别根据标准系列的浓度及相应的峰面积，建立回归方程。样品检测：实验结束后，每组随机取只小鼠脱臼处死，迅速剥离脑组织。分别称取约 的大脑皮层、中脑及小 脑 组 织，
9、于 冰 上 按照（）加 入 的乙腈水溶液（乙腈：水）并制备匀浆，、离心 ，取上清液。取 样品上清液按以上标准曲线步骤进行检测，将待测样品各氨基酸类经递质的峰面积纳入相应回归方程，计算种氨基酸类神经递质 、和 的含量。氨基酸类神经递质保留时间及标准曲线：含种氨基酸的混合标准进样后，在 内各组分能完全分开，、和 的保留时间分别为 、，见图。根据混合标准中 、的含量及峰面积绘制标准曲线，各神经递质的峰面积随浓度增加呈剂量依赖性升高，决定系数均在 以上，见图。图 、和 保留时间 大脑组织神经元变化采用尼氏染色（硫堇法）法。每组剩余只小鼠经腹腔注射水合氯醛麻醉，采用的多聚甲醛经心脏进行灌注，迅速剥离大脑
10、，置于的多聚甲醛中后固定，然后置于 蔗糖溶液中 至沉底。采用冷冻切片机制备 的冠状切片。切片经硫堇染色液染色 ，蒸馏水洗涤，梯度乙醇脱水，二甲苯透明后，中性树脂封片，使用显微镜观察（、），根据大脑神经元尼氏体着色的深浅及密度评价神经元损伤情况。统计学处理采用 统计软件。符合正态分布的计量资料以?表示，多组比较采用单因素方差分析，并用 法进行组间比较。以 为差异有统计学意义。结果 各组脑组织中种氨基酸类神经递质水平比较 各组大脑皮层中氨基酸类神经递质水平比较 组大脑皮层 高于 组、组，组、组 低于 组（）；各组其他指标比较差异无统计学意义（）。见表。预防医学论坛 年月第 卷第期 ，注：为天冬氨酸
11、；为谷氨酸；为甘氨酸；为牛磺酸；为氨基丁酸。图氨基酸类神经递质标准曲线 各组中脑中氨基酸类神经递质水平比较各组中脑中氨基酸类神经递质水平比较差异无统计学意义（）。见表。各组小脑中氨基酸类神经递质水平比较 组、组、组小脑 均高于 组，组 高于 组、组、组（）；各组其他指标比较差异无统计学意义（）。见表。各组大脑神经元变化 组大脑神经元胞质中尼氏体致密，着色较深。组、组及 组小鼠大脑神经元中尼氏体颜色变淡、着色颗粒稀疏，部分细胞中可观察到空泡现象；组大脑神经元中尼氏体变化最为明显。见图。表各组大脑皮层中氨基酸类神经递质水平比较（，?）组别 组 组 组 组 注：与 组相比，；与 组相比，。为天冬氨酸
12、，为谷氨酸，为牛磺酸，为甘氨酸，为氨基丁酸。表各组中脑中氨基酸类神经递质水平比较（，?）组别 组 组 组 组 注：为天冬氨酸，为谷氨酸，为牛磺酸，为甘氨酸，为氨基丁酸。表各组小脑中氨基酸类神经递质水平比较（，?）组别 组 组 组 组 注：与 组相比，；与 组相比，；与 组相比，。为天冬氨酸，为谷氨酸，为牛磺酸，为甘氨酸，为氨基丁酸。预防医学论坛 年月第 卷第期 ，图各组大脑神经元尼氏染色（硫堇法）讨论 作为环境中广泛存在的污染物，因其高脂溶性的特点，使得 进入机体后极易进入并蓄积在脑组织中。近年来，的神经毒性受到了广泛关注。在体外培养系统中，采用 的 处理 小鼠神经干细胞，可诱导细胞发生氧化应
13、激和细胞凋亡，且呈剂量依赖性。小鼠孕期暴露于 的 ，观察到新生小鼠新皮质神经元分布异常和神经元减少。如前所述，秀丽线虫、大鼠和小鼠暴露 可导致神经行为学功能障碍。大脑正常功能的维持依赖于神经元兴奋和抑制的动态平衡，该平衡与脑内 和 代谢密切相关。是大脑中丰度最高的兴奋性神经递质，主要存在于神经元和星形胶质细胞。以 作为递质的谷氨酸能神经元约占大脑神经元的，在大脑兴奋传递、突触可塑性及应激反应起关键作用。也广泛存在于脑组织中，作为脑内主要的抑制性递质，能降低大脑兴奋性、抑制突触传递。能神经元主要分布在大脑皮层、海马、下丘脑等部位，可以参与注意力、工作记忆和情绪等认知功能的调节。大脑神经元和星形胶
14、质细胞间存在 谷氨酰胺（，）代谢环路，是保持脑内 和 动态平衡和正常脑功能的关键通路。神经元谷氨酸脱羧酶催化 脱羧形成 ，然后经囊泡释放、与突触后膜受体结合发挥神经抑制作用，谷氨酸脱羧酶活性决定 合成速率。星形胶质细胞可摄取神经元释放的 ，在其特有的谷氨酰胺合成酶作用下，转化为 并被传递至神经元，然后重新转化为 ，参与神经信号传导。研究表明 比值过高或过低均会产生细胞毒性作用，导致神经元受损。本实验中，尽管未观察到 暴露及 喂养使小鼠大脑皮层 明显降低，但可观察到 水平明显升高。此外，三种处理方式均导致小鼠大脑皮层 降低。能够通过抑制兴奋性神经元阻断 的兴奋毒性，失调被认为是抑郁症和失眠的重要
15、影响因素。是突触后膜谷氨酸受体 甲基天冬氨酸（，）受体的 变构 调 节物，对兴奋性氨基酸产生的效 应 具 有 调 节 作用。和 作为甘氨酸受体（，）的激动剂具有抗惊厥作用。结果也显示，和 喂养均使小鼠大脑皮层和小脑 升高，联合处理组更加明显。与本研究的结果一致。等 给予 雄性小鼠分别含、和 的饲料，观察到小鼠表现出抑郁样行为，小鼠前额叶皮层中 和 降低、谷氨酰胺合成酶活性降低。神经元尼氏体是神经元胞体中的强嗜碱性物质，是神经元功能状态的标志。尼氏体主要为粗面内质网和游离核糖体，是神经元合成蛋白质的关键结构，代谢旺盛的神经元尼氏体丰富，神经元受损尼氏体减少甚至消失。本实验采用硫堇染色尼氏体显示，
16、暴露及 喂养，小鼠大脑皮层尼氏体着色变浅，着色颗粒密度降低；和 联合处理，尼氏体减少更加明显，提示长期低剂量 暴露和 喂饲均可使神经元损伤，且两者之间可能存在协同作用。综上所述，长期暴露和高脂饮食可导致小鼠大脑皮层及小脑抑制性氨基酸类神经递质水平升高，破坏脑内兴奋性氨基酸类神经递质和抑制性氨基酸类神经递质的内稳态，引起神经元损伤及丢失，这可能是高脂和 对中枢神经系统协同损伤的潜在机制之一。预防医学论坛 年月第 卷第期 ，参考文献 ，（），：，（），（）：，（）：，（）：，：，（）：，（），：，（），：，（），：，（）：，（）：，：，：，（）：，（）：，（）：，（），：，（），：，（）：，：，（）：，：，：，：，：，（）：武春阳，李炜，张丹参，等 脑内氨基酸水平与学习记忆能力的相关性 中国药理学与毒理学杂志，（）：，（），（）：，（）：，（）：，（）（），：作者贡献声明：郑刘根：开展动物实验以及后续指标检测，收集、整理及分析实验结果，撰写论文、修订论文；单姗：参与动物实验；程东：参与研究方案实施；李慧：参与病理指标检测及分析；姚文环：参与神经递质检测及数据处理；赵秀兰：参与研究思路设计、