1、河南农业科学，2023，52（1）：134143Journal of Henan Agricultural Sciencesdoi：10.15933/ki.10043268.2023.01.014miR-M11基因编辑对马立克病病毒体外复制的影响王伟东1，2，3，滕蔓1，3，郑鹿平1，3，刘金玲1，3，张文凯1，3，4，李林燕1，3，4，张志会1，2，3，樊剑鸣2，罗俊1，3，4（1.河南省农业科学院 动物免疫学重点实验室/农业农村部动物免疫学重点实验室/河南省动物免疫学重点实验室，河南 郑州 450002；2.郑州大学 公共卫生学院，河南 郑州 450001；3.河南省农业科学院 中英禽病国
2、际研究中心，河南 郑州 450002；4.河南科技大学 动物科技学院，河南 洛阳 471003）摘要：为探究病毒编码的微小RNA前体基因miR-M11对马立克病病毒（MDV）体外复制能力的影响，以MDV国内分离株HN302为研究对象，利用CRISPR/Cas9系统靶向编辑并敲除位于Mid基因簇的miR-M11，构建1株miR-M11基因编辑缺失毒株HN302M11（克隆号C58-8-4）。经过PCR鉴定、测序分析、间接免疫荧光试验（IFA）、实时荧光定量PCR（qPCR）以及传代稳定性分析，证实HN302编码的miR-M11被精确编辑并从病毒基因组中完全缺失，且未发生回复突变。病毒增殖曲线绘制
3、结果显示，miR-M11缺失毒株HN302M11的增殖速度显著高于亲本毒株HN302（P0.05）。综上，miR-M11是MDV复制的非必需基因，且其缺失后可增强MDV的体外复制能力。关键词：马立克病；miR-M11；微小RNA；CRISPR/Cas9；基因编辑；qPCR；复制中图分类号：S855.3文献标志码：A文章编号：1004-3268（2023）01-0134-10收稿日期：2022-06-01基金项目：国家自然科学基金项目（U21A20260）；河南省自然科学基金项目（212300410359）；河南省农业科学院自主创新项目（2022ZC65）作者简介：王伟东（1995-），男，河南
4、周口人，在读硕士研究生，研究方向：分子毒理学。E-mail：通信作者：罗俊（1978-），男，河南罗山人，研究员，主要从事动物病毒学研究。E-mail：樊剑鸣（1971-），男，河南罗山人，副教授，主要从事分子毒理学研究。E-mail：Effect of miRM11 Gene Editing on Replication of Marek s DiseaseVirus in VitroWANG Weidong1，2，3，TENG Man1，3，ZHENG Luping1，3，LIU Jinling1，3，ZHANG Wenkai1，3，4，LI Linyan1，3，4，ZHANG Zhihu
5、i1，2，3，FAN Jianming2，LUO Jun1，3，4（1.Key Laboratory of Animal Immunology，Henan Academy of Agricultural Sciences/Ministry of Agriculture and RuralAffairs&Henan Provincial Key Laboratory of Animal Immunology，Zhengzhou 450002，China；2.College of PublicHealth，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001，China；3.
6、UKChina Centre of Excellence for Research on AvianDiseases，Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450002，China；4.College of Animal Science andTechnology，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003，China）Abstract：In order to explore the effect of virusencoded miRNA precursor m
7、iRM11 on the in vitroreplication ability of MDV，the domestic isolate HN302 of MDV was used as the parental virus，and theCRISPR/Cas9 system was used to targetedly edit and knock out miRM11 located in the Mid gene cluster，to construct a miRM11 gene editing deletion strain HN302M11（clone number C5884）.
8、After PCRidentification，DNA sequencing，indirect immunofluorescence assay（IFA），realtime quantitative PCR（qPCR），and passage stability analysis，it was confirmed that the miRM11 encoded by HN302 was第 1 期precisely edited and completely deleted from the viral genome，and no reverse mutation occurred.Theres
9、ults of the virus proliferation curve assay showed that the proliferation rate of the miRM11deletedvirus strain HN302M11 was significantly higher than that of the parental virus strain HN302（P0.05）.In conclusion，miRM11 is a nonessential gene for MDV replication，and its deletion can enhance the invit
10、ro replication ability of MDV.Key words：Marek s disease；miRM11；miRNA；CRISPR/Cas9；Gene editing；qPCR；Replication马立克病病毒（Marek s disease virus，MDV）是一类具有细胞结合性和嗜淋巴细胞特性的疱疹病毒，感染宿主鸡可诱发马立克病（Marek s disease，MD），该病以淋巴细胞增生和内脏肿瘤形成为主要特征1。自 1907年该病首次报道2后，目前世界范围内均存在MD的流行，每年给全球家禽养殖业造成了巨大的经济损失3。尽管早期使用疫苗免疫雏鸡来防控MD取得了较好的
11、成效，但随着MDV毒力的增强，部分流行毒株的毒力突破了现有MD疫苗的免疫保护，使得MD疫情仍时有暴发48。MicroRNA（miRNA）是一类小的非编码RNA分子，长度2224 nt。自从LEE等9首次在秀丽隐杆线虫中发现lin-4后，越来越多的miRNA在动物、植物以及病毒中被发现10。这些小分子RNA在细胞的发育与分化、疾病发生、肿瘤形成等生物学过程发挥重要的调控功能1112。目前已鉴定出500多个病毒miRNA，其中绝大多数编码于各种人类或动物疱疹病毒基因组中13。作为疱疹病毒家族的重要成员，血清 1型 MDV（MDV-1）编码 14个 miRNA前体基因，可表达加工生成26个成熟体mi
12、RNA，在MDV基因组反转重复序列区中共形成 3 个基因簇，即Meq基因簇、Mid基因簇和LAT基因簇1415。虽然少数几个病毒miRNA已被证明参与调控MDV的基因表达、肿瘤发生或潜伏感染1625，但大部分 MDVmiRNA的潜在功能和分子调控机制仍不清楚。基 于 成 簇 的 规 律 性 间 隔 短 回 文 重 复 序 列（Clusterregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat，CRISPR）和 CRISPR 相关蛋白 9（Cas9）系统的基因编辑技术，自2013年首次应用于哺乳动物真核细胞基因编辑以来，因其设计简单、成本低、效率高而被广泛应用于多
13、种生物学研究领域。在病毒学领域尤其是疱疹病毒的基因功能及疫苗研究中，该技术也已展现出巨大的技术优势2628。随着CRISPR/Cas9系统首次应用于改造 MDV 基因组以来，国内外学者通过该系统成功构建了一系列MDV蛋白质编码基因（如 meq、pp38、gB）和 miRNA 基因编辑缺失毒株2934，为深入研究MDV的基因功能和致病机制提供了新的技术支撑。鉴于此，以MDV国内分离株HN302为研究对象，利用CRISPR/Cas9系统构建 HN302 的 miR-M11 前体基因缺失毒株，探究miR-M11缺失后对MDV体外复制能力的影响，旨在为MDV编码的miRNA的调控功能及分子机制研究奠定
14、基础。1材料和方法1.1试验材料鸡胚成纤维细胞（Chicken embryo fibroblast，CEF）由910日龄SPF鸡胚制备；MDV毒株HN3027以及pMD18T-gB/meq/OVO质粒为河南省农业科学院动物免疫学重点实验室保存；pX459 v2.0基因编辑质粒、鼠源抗 MDV-pp38 单克隆抗体和兔源抗MDV-Meq 多 克 隆 抗 体 由 英 国 Pirbright 研 究 所Venugopal Nair教授馈赠；鼠源抗MDV-gB单克隆抗体由山东农业大学崔治中教授馈赠。1.2主要试剂M199、Opti-MEM 培养基购自 Gibco 公司；10Annealing Buff
15、er 购自北京索莱宝科技有限公司；TransIT-X2Dynamic Delivery System购自Mirus Bio公司；TIANamp Genomic DNA Kit 和 TIANgel MidiPurification Kit购自TIANGEN公司；E.Z.N.AEndo-free Plasmid Mini Kit 购自 Omega Bio-Tek 公司；2Easy TaqPCR SuperMix、Trans1-T1 感受态细胞购自北京全式金生物公司；T4连接酶和Bbs-HF酶购自NEB公司；DyLight 488/594 羊抗鼠/兔 IgG购自 Abbkine 公司；pMD-18T
16、 载体、PrimeScript RTMaster Mix 购 自 TaKaRa 公 司；FastStart UniversalSYBR GreenMaster（ROX）购 自 Roche 公 司；TaqManMicroRNAReverseTranscriptionKit、TaqMan Probe、TaqMan Universal Master Mix 、TaqManMicroRNA Assays购自Thermo Fisher公司。1.3试验方法1.3.1gRNA 及 PCR 引 物 设 计 与 合 成利 用Benchling（https:/）在线设计软件，分别设计靶向Mid基因簇miR-M11茎环结构及王伟东等：miR-M11 基因编辑对马立克病病毒体外复制的影响135河南农业科学第 52 卷其邻近序列的gRNA，其中非G开头的gRNA oligo序列在其5端加上额外的1个G，并在序列5端添加Bbs的酶切位点（表 1），gRNA 靶点见图 1。利用Premier Primer 5.0软件设计聚合酶链式反应（PCR）和实时荧光定量PCR（qPCR）引物，基因序列见表1，均由生工生物工程（