1、杨琪，王艳玲.基于分子动力学模拟的扩展青霉棒曲霉素 MFS 蛋白转运机制研究 J.食品工业科技，2023，44（18）：200208.doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022110341YANG Qi,WANG Yanling.Investigation on the Transport Mechanism of Penicillium expansum MFS Protein Based on MolecularDynamics SimulationJ.Science and Technology of Food Industry,2023,44(18):20020
2、8.(in Chinese with English abstract).doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022110341 生物工程 基于分子动力学模拟的扩展青霉棒曲霉基于分子动力学模拟的扩展青霉棒曲霉素素MFS 蛋白转运机制研究蛋白转运机制研究杨琪，王艳玲*（兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃兰州 730050）摘要：扩展青霉可产生具有毒性的次生代谢产物棒曲霉素。PatC 基因编码 MFS 转运蛋白将棒曲霉素的前体物质转运至胞外，在棒曲霉素防治中具有较高的参考价值。为研究 PatC 蛋白的转运机制，利用生物信息学方法预测PatC 的空间结构，采用分子对接和分子
3、动力学模拟解析棒曲霉素前体分子（E-ascladiol）与 PatC 的作用位点及可能的作用机制。结果表明，该蛋白含有 546 个氨基酸，含有 14 个跨膜螺旋且具有 MFS 功能结构域；分子对接结果显示，该蛋白与 E-ascladiol 存在 4 个结合位点，分别为 SER353、TYR336、PRO339、PRO188。针对 Wild 蛋白复合体系及 P188A 突变体系进行 200 ns 的分子动力学模拟，结果显示小分子底物与 PatC 结合紧密，且位于氨基酸序列 Pro188Ser197aa 和 Gly231Val241aa 区域内形成复合体后，蛋白的柔性发生强烈变化，由此可推测这两个
4、区域可能存在作用位点。通过对 P188A 突变体系的各参数数据的分析，可以预测 PRO188 作为 PatC 的重要靶点，为后续的分子实验提供基础理论。该研究结果为探索棒曲霉素的转运机制奠定基础，为防治苹果腐烂提供了新策略。关键词：扩展青霉，棒曲霉素，MFS 转运蛋白，分子对接，分子动力学本文网刊:中图分类号：Q963 文献标识码：A 文章编号：10020306（2023）18020009DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2022110341InvestigationontheTransportMechanismofPenicilliumexpansumMFSProte
5、inBasedonMolecularDynamicsSimulationYANGQi，WANGYanling*（School of Life Science and Engineering,Lanzhou University of Technology,Lanzhou 730050,China）Abstract：The Penicillium expansum produces a toxic secondary metabolite,patulin.The PatC gene encodes the MFStransport protein,and transports the patul
6、in precursor substance to the extracellular space,ultimately forming PAT.This hashigh reference value in the prevention of patulin.In order to study the transport mechanism of the PatC,the spatial structureof the PatC was predicted by using bioinformatics methods,and the interaction site and possibl
7、e mechanism of E-ascladioland the PatC were analyzed by molecular docking and molecular dynamics simulation.The results showed that the geneencoded 546 amino acids,containing 14 transmembrane helix and MFS functional domains.The molecular docking resultsshowed that the protein had 4 binding sites wi
8、th the E-ascladiol,namely SER353,TYR336,PRO339,and PRO188.Molecular dynamics simulations of 200 ns were performed for the Wild protein complex system and the P188A mutantsystem.The results showed that the small molecule substrate and the PatC were tightly bound,and that the proteinsflexibility chang
9、ed strongly after forming a complex in the Pro188Ser197aa and Gly231Val241aa regions.It could beinferred that these two regions might have functional sites.By analyzing the parameter data of the P188A mutant system,itcould be predicted that PRO188 was an important target of the PatC protein,which co
10、uld provide a basis for subsequentmolecular experiments.The results of the research could lay the foundation for exploring the transport mechanism ofpatulin,and provide new strategies for the prevention of apple rot.收稿日期：20221201 基金项目：国家自然科学基金地区科学基金项目（31760494，31560486）；甘肃省青年博士基金项目（2021QB-045）；甘肃省科技
11、计划项目（21JR7RA219）。作者简介：杨琪（1996），女，硕士研究生，研究方向：微生物代谢及调控，E-mail：。*通信作者：王艳玲（1985），女，博士，副教授，研究方向：微生物代谢及其调控，E-mail：。第 44 卷 第 18 期食品工业科技Vol.44 No.182023 年 9 月Science and Technology of Food IndustrySep.2023 Keywords：Penicillium expansum；patulin(PAT)；MFS transporter；molecular docking；molecular dynamics 青霉病是全球
12、最常见且经济上最重要的采后水果腐烂病之一1，其中扩展青霉（Penicillium expansum，P.expansum）是引起果实青霉病或软腐病的主要病原菌2。P.expansum 可在水果作物（苹果、梨、柑橘和樱桃等）及其衍生品、加工产品的采后、贮藏、运输和加工期间侵袭37。同时，P.expansum 还可产生具有危害的次级代谢产物棒曲霉素（Patulin，PAT）810，通过诱导 DNA 链断裂、氧化损伤以及DNA 链之间相互交联、产生核质桥等机制影响微核形成，从而引起 DNA 结构性损伤11，产生遗传毒性、细胞毒性和免疫毒性作用等12。20 世纪 80 年代，Puel 等提出 PAT
13、的生物合成途径是一个酶级联反应1314。近几年，Li 等15鉴定得到参与 PAT 生物合成的基因簇，包括 15 个基因（PatAPatO），具体合成途径见图 1。其中 PatC 基因编码 MFS 超家族转运蛋白（Major Facilitator Super-family，MFS）。MFS 的主要功能是将 PAT 的前体E-ascladiol 转运至胞外，最终合成 PAT16，但具体的转运机制尚不清楚。研究表明，E-ascladiol 对来自人类肝、肾、肠和免疫系统的细胞无毒性，因此，增加E-ascladiol 累积以减少棒曲霉素含量是控制棒曲霉素风险的有效手段17。目前，MFS 转运蛋白包括
14、105 个家族，是最大的次级跨膜转运蛋白超家族18。MFS 转运蛋白大多数都含有 400600 个氨基酸残基19，具有 12、14 或 24 个不规则跨膜-螺旋（TMSs）包围形成深中央亲水腔2021，催化底物在两个方向上进行跨膜运输，可以是运输单个底物的单转运子，可以是将底物和偶联离子运输在一起的同转运子，也可以是按相反方向依次运输两个不同分子的反转运子（图 2a）。根据交替开放模型，MFS 能够在向胞内开放，闭塞和向外开放构象之间变化（图 2b），转运蛋白上的底物结合位点暴露在细胞膜的不同侧，底物从细胞膜的一侧结合到蛋白上，而从另一侧被释放（图 2c）。此外，MFS 转运蛋白还可以间接调节
15、真菌的内部 pH和应激反应机制22，参与多种真菌毒素的输出。如拟枝孢镰刀菌（Fusarium sporotrichioides）的 TRI12和大豆紫斑菌（Cercospora kikuchii）的 CFP2324，两者均编码 MFS 转运蛋白，分别参与真菌毒素-单端孢霉烯（Trichothecenes）和尾孢菌素（Cercosporin）的分泌。植物病原体，玉米圆斑真菌（Cochlioboluscarbonum）的 TOXA 也与 HC 毒素的宿主特异性毒素的分泌有关2526。TOXA、Tri12 及 CFP 缺失突变体都显示出毒素产生的急剧减少，Tri12 缺失突变体也观察到生长迟缓，但
16、CFP 缺失突变体与野生型菌株一样正常生长，只是对大豆的毒力降低2628。此外，在携带毒素合成基因的基因簇中也发现了一些编码 MFS 的基因29。然而，它们在运输特定代谢产物中的作用仍待阐明。可惜的是，对 MFS 转运机制的研究甚少，目前只解析得到几个细菌蛋白的完整拓扑结构。相关 PAT 毒素输出的研究更是没有。因此致力于探索 PatC 的转运机制，有利于苹果青霉病病原菌的防治的研究。OOOOOOHOOOOOOOOOOOOOHOHOHOHOHOHOHOHHOHOHOHOHCH2CH2COOHCoACoAssHOHOHOHOOHPatEPatC/PatM?PatJ/PatOPatHPatG Pa
17、tFPatE PatD PatCPatB PatA PatMPatN PatO PatL PatI PatJPatKPatFPatNPatDPatGPatAPatAVelBVeALaeAPacCCreAPatHPatI?PatKE-ascladiol图 1 PAT 的生物合成途径30Fig.1 PAT biosynthetic pathway30 第 44 卷 第 18 期杨琪，等：基于分子动力学模拟的扩展青霉棒曲霉素 MFS 蛋白转运机制研究 201 Inward openOccludedOutward openExtracellularUniporterCytoplasmicN-domai
18、n C-domainSymporterExtracellularCytoplasmicAntiporterABC图 2 MFS 蛋白的运输机制31Fig.2 Mechanism of transport of MFS31注：A.运输单个基质的单转运蛋白，将基质和耦合离子共同运输的同转运蛋白，在相反方向顺序运输两个不同分子的反转运蛋白；B.表示向内开放、闭塞和向外开放构象的待确定结构；C.MFS 蛋白不会同时向两侧开口，蛋白上底物结合位点同时暴露在细胞膜的不同侧。随着计算生物学的发展，越来越多的研究者采用分子动力学模拟生物大分子在三维空间的运动状态，从而分析其发挥生物功能的作用机制。本研究采用生
19、物信息学及分子动力学模拟方法探索扩展青霉棒曲霉素 PatC 的转运机制，研究其与底物分子 E-ascladiol 的结合位点，并针对 PRO188 定点突变，分析复合体及突变体的 RMSD、Rg、RMSF 等变化，以期为研究该蛋白的结构和转运机制奠定基础。1材料与方法 1.1生物信息学分析通过美国国家生物技术信息中心（National Cen-ter for Biotechnology Information，NCBI）搜索 Penicil-lium expansum T01（登录号：AYHP00000000.1），下载 Penicillium expansum T01 中全部 527 段鸟枪
20、法测序结果。利用 DNAMAN 生物信息软件 BLAST其他亚种 Penicillium expansum strain NRRL 35695（登录号：KF899892.1）中 PatC 基因及其编码的氨基酸信息，结果与 Penicillium expansum T01 中 PatC 基因序列完全一致。采用 Mega 5.0 邻近法（NeighborJoining，NJ）进行氨基酸序列同源性分析及构建系统进化树；通过在线网站分析 PatC 的理化性质、跨膜结构域、蛋白质功能结构域、二级结构及三级结构等，具体所用网站见表 1。1.2分子对接配体分子和蛋白三维结构的优化：分子对接用于验证活性成分与
21、关键靶点之间的结合活性。通过AlphaFold 蛋白质三维结构数据库在线搜索 PatC 的三维结构，再对其三维模型导入 AutoDocktools（v1.5.6）进行加氢、计算电荷、分配电荷、指定原子类型等优化处理；从 Pubchem 数据库下载小分子或蛋白的 3D 结构，导入 ChemBio3D Ultra 14.0 进行能量最小化。将优化好的小分子导入 AutodockTools-1.5.6 进行加氢、计算电荷、分配电荷等处理。分子对接：AutoDock Vina1.1.2 是一个采用半柔性对接方法运行的程序，对接精度高达 78%，被用来作为本研究的分子对接程序32，分子对接流程如图 3。
22、1.3分子动力学模拟先将 Wild PatC 和 E-ascladiol 对接的最佳结合构象，作为初始复合物结构进行 MD 模拟。随后使用蛋白定点突变软件，构建新型 PatC 突变体结构（P188A）观察突变后的蛋白与底物对接后复合物的活性。具体操作如下：使用分子动力学软件 Gromacs2020.6 进行模拟。复合物小分子在 GAFF 力场下生成拓扑文件，蛋白在 AMBER99SB-ILDN 力场生成相应参数化文件。以复合物为中心，添加 SPC/E 水模型分子，生成立方体水盒子，向复合物水盒子里添加4 个 CL-离子保持模拟体系的电中性。在体系完成后，使用最陡能量下降法进行 50000 步能
23、量最小化，使体系充分稳定。采用正则系综（NVT），Berendsen 热浴法控制温度为 298.15 K，模拟 50000 步，步长 2 fs。采用等温等压系综（NPT），Parrinello-Rahman 控压，1 个大气压，模拟 50000 步，步长 2 fs。进行 mdrun，步长 2 fs，模拟 10000000，总计 20 ns 的模拟，对模拟后的数据计算 MMPBSA。表 1 生物信息学相关分析工具Table 1 Bioinformatics correlation analysis tools网站名称网址功能SMARThttp:/smart.embl.de/蛋白的功能结构域NCB
24、INCBI Conserved Domain Search（nih.gov）蛋白的功能结构域ExPASy-ProtParamhttps:/web.expasy.org/protparam/蛋白的理化性质TMHMM-2.0http:/www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM蛋白的跨膜结构SOPMAhttps:/npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa%20_sopma.html蛋白的二级结构AlphaFoldhttps:/www.alphafold.ebi.ac.uk/蛋白的三级结构Uniprothttps:/ww
25、w.uniprot.org/蛋白质数据库 202 食品工业科技2023 年 9 月数据处理PDB数据库下载蛋白质结构PubChem数据库下载有机小分子加氢、计算电荷、分配电荷等预处理能量最小化加氢、计算电荷、分配电荷等预处理数据分析AutoDock Vina分子对接导入Pymol绘制氨基酸作用位点Discovery studio对分析结果进行可视化图 3 分子对接流程示意图Fig.3 Schematic diagram of the molecular docking process 1.4数据处理利用 Discovery studio 2016 对分子对接结果进行可视化，且利用 PyMOL（
26、4.3.0 版）软件绘制蛋白与分子之间相互作用的氨基酸残基。分子动力学模拟使用软件 gromacs 分析各组参数变化，最终通过程序统计结果文件计算出体系各种宏观性质和微观性质，并使用 xmgrace 绘制相应的数据图，如 RMSD、RMSF、SASA 及氢键变化等。PAT 生物合成图（图 1）使用在线网站 FigDraw（https:/）绘制，图 2 使用 Adobe Illustrator 软件绘制。2结果与分析 2.1构建系统进化树选取与 PatC 同源性较高的多条已知菌株的氨基酸序列（表 2），利用 MEGA5.0 软件构建 NJ 系统进化树（图 4）。所选的 11 个物种序列与 Pat
27、C 的氨基酸序列一致性较高。系统进化树结果表明，Penicilliumexpansum（扩展青霉）与 Penicillium griseofulvum（灰黄青霉）处于同一分支，亲缘关系较近。此现象可能是因为两者的 PAT 合成基因簇均包含相同的 15 个基因，且基因排布顺序相同。此外，与 Penicilliumdigitatum（指状青霉）和 Penicillium italicum（意大利青霉）关系较远，推测是因为两者均只含有棒曲霉素生物合成基因簇的部分基因且不产生 PAT33。表 2 11 个 MFS 转运蛋白登录号Table 2 11 MFS transporters accession
28、 numbers种名蛋白登录号序列一致性Penicillium polonicumOQD65553.195.60%Penicillium crustosumKAF7524359.195.06%Penicillium freiiKUM63383.195.06%Penicillium camembertiCRL29157.195.06%Penicillium solitumXP_040815823.194.88%Penicillium coprophilumOQE43159.192.32%Penicillium italicumKGO71590.192.21%Penicillium griseof
29、ulvumXP_040649532.191.94%Penicillium roquefortiKAI3112831.191.41%Penicillium digitatumKAG0160219.188.67%Penicillium vulpinumOQE09870.188.27%2.2蛋白结构功能域预测利用 NCBI Domains&Structures 对 PatC 进行功能结构域预测分析。如图 5 结果表明，该蛋白氨基酸序列 53aa480aa 为 MFS 结构域，验证 PatC 属于 MFS 转运蛋白超家族。Paulsen 等34研究 MFS家族时发现，大多数 MFS 蛋白的保守特征序列
30、是基序 A（GrLaDrfGrRRv）、基序 B（LvaaRvlQGxGA）和基序 C（gxxxGPxxxGGxl），其中位于 TMS4 内的基序 B 参与大多数 MFS 成员的质子转移。Jiang 等35提出基序 A 是 MFS 成员中高度保守的基序，位于TMS 2 和 TMS 3 之间的环中，在构象调节中起着至关重要的作用，特别是对外构象的稳定性。此外，Motif C 被称为反转运基序，在 TMS5 内形成纽扣，可能与底物结合位点的取向有关36。2.3理化性质分析利用在线软件 ProtParam 对 PatC 的理化性质进行预测，结果显示（表 3），PatC 的氨基酸数量是546 个，分子
31、量为 58733.15；理论等电点 PI：5.57，为 Penicillium polonicumPenicillium crustosumPenicillium freiiPenicillium camembertiPenicillium solitumPenicillium coprophilumPenicillium italicumPenicillium griseofulvumPenicillium expansumPenicillium roquefortiPenicillium digitatumPenicillium vulpinum656477791001009676910.
32、050图 4 PatC 的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of PatC 第 44 卷 第 18 期杨琪，等：基于分子动力学模拟的扩展青霉棒曲霉素 MFS 蛋白转运机制研究 203 酸性蛋白；该蛋白氨基酸序列中亮氨酸（Leu）、甘氨酸（Gly）及丙氨酸（Ala）三种氨基酸含量较高，所占比值分别为 12.1%、10.1%和 9.7%；蛋白不稳定指数：40.3，为不稳定蛋白；从脂肪系数数据分析表明该蛋白脂肪系数：113.77，为脂溶性蛋白。亲水性平均系数（GRAVY）值为 0.712，表明该蛋白为疏水性蛋白。2.4跨膜结构预测采用在线软件 TMHMM 对 PatC 的跨膜
33、结构进行预测，由图 6 和上述理化性质结果表明该蛋白具有强疏水性氨基酸，具有能够行使跨膜转运的功能，符合转运蛋白的特点。1.201.01000.82000.63000.44000.25000概率位置TransmembraneInsideOutside图 6 PatC 跨膜区预测Fig.6 Transmembrane structure prediction of PatC 2.5蛋白质二级结构预测利用在线 SOPMA 软件对 PatC 二级结构进行预测和分析（图 7），PatC 中二级结构主要存在 4 种：-螺旋、-转角、-折叠和无规则卷曲。二级结构元件中-螺旋所占比例最高，此外无规则卷曲、-
34、折叠和-转角所占比例依次减少分别为 30.95%、24.73%和 6.23%。2.6蛋白质三级结构预测PatC 同源性蛋白较少，无法利用 SWISS MODEL同源建模方法得到其三级结构。因此通过 AlphaFold预测 PatC 的三级结构。由图 8 说明该蛋白是 14 次-螺旋结构（与跨膜结构预测相吻合），可能是进化过程中以 12 次跨膜-螺旋为基础产生的37，分为 2 个结构域：N 端结构域和 C 端结构域。每个结构域都由 6 个-螺旋组成，2 个结构域呈现二次赝对称（two-fold psudosymmetry）20。与大肠杆菌中的二肽转运蛋白（Escherichia coli Ybg
35、H，EcYbgH）结构类似，为 图 5 PatC 的功能结构域预测Fig.5 Prediction of functional domains of PatC 表 3 PatC 的理化性质分析Table 3 Physicochemical property analysis of PatC蛋白名称氨基酸残基分子量理论等电点蛋白不稳定指数脂肪系数亲水性平均系数主要氨基酸PatC54658733.155.5740.3113.770.712Leu、Gly、Ala 01002003004005000100200300400500HelixSheetTumCoi图 7 PatC 的二级结构预测Fig.7
36、 Secondary structure prediction of PatC N-domain C-domain图 8 PatC 的三级结构预测Fig.8 Tertiary structure prediction of PatC 204 食品工业科技2023 年 9 月经典的 12 次跨膜-螺旋构象加两个 TM 螺旋的插入（HA 和 HB）38。2.7分子对接采用 AutoDock Vina1.1.2 将 PatC 与 E-ascladiol进行半柔性对接，分子对接结果如图 9，其之间的平均结合能为5.0 kcal/mol（0），说明配体和受体蛋白可以自发结合。PatC 与 E-ascla
37、diol 之间主要以传统氢键（Conventional hydrogen bond）、堆积键（Pi-Pi T-shaped）及疏水作用力（Pi-Alkyl）相互作用。具体相互结合模式：E-ascladiol 与 PatC 结合至蛋白空腔，且与该蛋白受体的氨基酸残基 SER353、TYR336、PRO339、及 PRO188 分别形成 2.74氢键，2.96Pi-Pi 堆积作用力，5.21和 529疏水作用力，这些相互作用使得蛋白质与小分子紧密结合。AromaticEdgeFacePi-AlkylPi-Pi T-shapedPi-PiConventionalABOOOOSERA:353TYRA:
38、336PROA:188PROA:339InteractionsConventional hydrogen bondPi-Pi T-shapedPi-AlkylCPro188(A)Val335(A)Thr65(A)Ala354(A)Gln343(A)Pro339(A)Gly350(A)Tyr336(A)Ser353(A)E-ascladiolDAromaticEdgeFacePi-AlkylPi-Pi T-shapedPi-PiConventionalABOOOOSERA:353TYRA:336PROA:188PROA:339InteractionsConventional hydrogen b
39、ondPi-Pi T-shapedPi-AlkylCPro188(A)Val335(A)Thr65(A)Ala354(A)Gln343(A)Pro339(A)Gly350(A)Tyr336(A)Ser353(A)E-ascladiolD图 9 PatC 与 E-ascladiol 的分子对接Fig.9 Molecular Docking of PatC and E-ascladiol注：A.PatC 与 E-ascladiol 3D 分子对接；B.PatC 与 E-ascladiol相互作用；C.PatC 与 E-ascladiol 结合位点及相互作用力；D.蛋白与分子结合复合物。2.8分子动
40、力学模拟 2.8.1 RMSF 分析RMSF（Root Mean Square Fluctu-ation，RMSF）是用来衡量一段时间内分子结构中原子位置的平均移动，是目的结构特定原子相对于参照结构在整个时间范围内的距离均方根，是判断蛋白质结构结构变化的重要参数之一39。通过 Protein（纯蛋白）与 Wild（野生型复合体）的RMSF 数据分析，如图 10 所示，PatC 在多个氨基酸位点发生柔性变化。与野生型复合物对比，纯 PatC 分别在 第127、181、188197、231241、273、296、333341、457463 位残基区域即（Ala127、Gly181、Pro188Se
41、r197、Gly231Val241、Asp273、Phe296、Val333Try341、Gln457Ala463）发生了形变拉伸或缩短。其中位于 Pro188Ser197aa、Gly231Val241aa 氨基酸区域内，结合底物分子后的 PatC 发生柔性变化，在一定程度上增加其灵活度，改变其空间构象。因此可推测出上述氨基酸区域内可能存在 PatC 与 E-ascla-diol 之间的结合位点。0.500.41000.32000.23000.14000500RMSF(nm)Residue5873127181188197231241273296333341457463ProteinWild图
42、10 各模拟体系的 RMSF 结果分析Fig.10 Analysis of RMSF results for each simulation system 2.8.2 点突变分析通过上述分子对接和复合物分子动力学模拟两种方法得出不同的结合位点。由图 11可知，MD 计算得到 6 个结合位点，其中第 188 位氨基酸与分子对接结果重叠，且与 RMSF 数据相吻合，因此使用 Pymol 软件对 PatC 中第 188 位氨基酸残第 44 卷 第 18 期杨琪，等：基于分子动力学模拟的扩展青霉棒曲霉素 MFS 蛋白转运机制研究 205 基位点突变，将原有的脯氨酸（P）突变为丙氨酸（A），即产生新的
43、P188A 的 PatC 突变体。通过将 PatC 与P188A 的突变位点进行构象对比，如图 12，发现在第 188 位氨基酸位置上的点突变并未使该位点的二级结构出现明显差别，且不影响整体蛋白质构型，因此继续使用此结果进行后续实验研究。0123456结合能(kcal/mol)188P189I351I354A196D339P图 11 各个结合位点的总结合能Fig.11 Total binding energy of each binding site AB图 12 PatC 及其突变体结构Fig.12 Structure of PatC and its mutant注：A 为野生型 PatC
44、蛋白与 E-ascladiol 结合的情况；B 为PatC 突变体蛋白与 E-ascladiol 结合的情况。2.8.3 RMSD 分析RMSD（Root Mean Square Dist-ance/Deviation，RMSD）是用来衡量同一分子结构不同构象之间的差异，常用来分析体系分子整体结构的稳定性，RMSD 变小表明结构趋于稳定，反之趋于不稳定39。将纯 Protein（纯蛋白）、Wild（野生型复合体）、P188A（突变体复合体）三个复合体系体系分别进行了 20 ns 的分子动力学模拟实验。在对其数据进行采集和分析中，三个模拟体系结构中的原子骨架的根均方偏差 RMSD 值如图 13
45、所示。当反应进行至 15 ns时，三个反应体系曲线趋于平稳，虽有一定的波动，但范围在 0.05 nm 之内。说明三个体系均达到了平衡状态，且三个反应体系的 RMSD 终值都停留在 0.3 nm以下，其中 Protein、Wild 复合体系和 Mutant 复合体系的 RMSD 平均值分别为 0.17、0.23 和 0.18 nm 左右，可看出三者在模拟过程中结构均保持稳定。且相较于 Wild，Mutant 稳定性更佳。2.8.4 Rg 分析Rg（Radius of Gyratio，Rg）回旋半径用来衡量分子结构的紧密度或折叠程度，Rg 考察主要选择平衡时状态进行39，因此主要选择后 10 ns
46、进行分析，由图 14 可得，后 10 ns 两个反应体系中 0.2500.2050.15100.10150.05200RMSD(nm)Time(ns)ProteinWildA0.250.200.150.100.050RMSD(nm)05101520Time(ns)WildMutantB0.250.300.200.150.100.050RMSD(nm)ProteinWildC0.250.200.150.100.050RMSD(nm)WildMutantD图 13 各模拟体系的 RMSD 结果分析Fig.13 Analysis of RMSD results for each simulation
47、 system注：A 为纯蛋白 Protein 与 Wild 蛋白复合体的 RMSD 对比；B 为 Wild 蛋白与突变体的 RMSD 对比；C、D 为 RMSD 平均值对比图。A2.3402.3250002.30100002.28150002.26200002.24ProteinWildRg(nm)Time(ps)206 食品工业科技2023 年 9 月Rg 变化均很小，表明这三个反应体系稳定且在反应过程中均为平衡状态且复合物结构致密，且三个反应体系的平均值均在 2.5 nm 以下，并且空白蛋白的 Rg值最高，两种结合底物分子的复合物体系中 Rg 值均有明显减少，由此可见在 PatC 结合了
48、底物分子后，整体构象进行了收缩。3结论本研究基于 PatC 与 E-ascladiol 结合的前提下，运用生物信息学、分子对接和分子动力学模拟方法预测蛋白与分子之间的重要作用位点，以研究PatC 转运机制。生物信息学结果表明，该蛋白的二级结构以为-螺旋和无规则卷曲为主，三级空间构象含有 14 个跨膜螺旋，含有 2 个结构域：N 端结构域和 C 端结构域，形成独特的 MFS 折叠。根据以上结果说明 PatC 作为毒素输出泵转运 PAT，但其理化性质也需进一步的验证。分子对接结果表明 PatC与 E-ascladiol 之间存在多个结合位点与多种相互作用力，与 RMSF 数据结合分析得出 P188
49、 作为重要结合位点并对其进行模拟突变。此外，本研究通过分子动力学方法对两种复合体系（野生型 Wild 和突变体P188A）进行各参数分析，结果说明 P188 氨基酸位点可能是 PatC 的关键作用位点，可为后续的微生物分子实验提供基础论证。综上所述，本文为棒曲霉素合成途径中的 MFS 蛋白的转运机制（毒素外排作用）提供一定的基础，并进一步为毒素输出泵的生物学功能与转运机制研究提供参考。参考文献 1 ZHONG L,CARERE J,LU Z,et al.Patulin in apples and ap-ple-based food products:The burdens and the mi
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