1、第2 期孙乾等:不同莲子蛋白氨基酸结构与热特性研究45中国食物与营养2023，29(2):45-51Food and Nutrition in China基金项目:福建省自然科学基金面上项目(项目编号:2020J01559);福建农林大学科技创新专项基金(项目编号:CXZX2019092G)。作者简介:孙乾(1983)，男，博士研究生，研究方向:食品营养与化学。通信作者:郭泽镔(1986)，男，博士，副教授，研究方向:食品加工技术、食品营养与化学。不同莲子蛋白氨基酸结构与热特性研究孙乾1，2，郭增铮3，郑玮雯3，吴钰涵3，郭泽镔1，2(1福建农林大学食品科学学院，福州350000;2福建农林大
2、学中爱国际合作食品物质学与结构设计研究中心，福州350000;3福建农林大学金山学院，福州350000)摘要:目的:研究不同莲子蛋白(分离蛋白、清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白)的氨基酸组成结构与热特性的差异。结果:谷氨酸含量均占比最高，且含有较多带负电荷的极性氨基酸基团。莲子蛋白的 E/T、E/N 比值与 FAO/WHO 提出氨基酸比值接近，说明莲子蛋白氨基酸组成与含量均衡。电子能谱中硫元素谱图显示，清蛋白具有更高的吸收峰值，表明其他蛋白中可能含有较多的二硫键，而巯基含量较少。热特性分析表明，莲子蛋白在 90 时逐渐变性，200 后发生玻璃化转变，内部有序结构向无序转变。其中分离蛋白、醇溶蛋
3、白、谷蛋白的热变性温度高，可能是因为分子内部二硫键含量较高，结构紧密，且在热特性变化中重量损失更大，功能性基团改变。结论:分析不同莲子蛋白氨基酸组成、含量以及热特性的差异性，可为莲子蛋白更深入的基础性研究提供科学依据。关键词:莲子蛋白;分离蛋白;分级蛋白;氨基酸特性;热特性莲子为睡莲科植物莲的成熟种子，是中国特有的种质资源和经济作物。莲子营养丰富，含有丰富的蛋白质1-3，因种质资源的不同，蛋白含量最高可达25%4，且富含多种氨基酸成分5。国内外研究学者对莲子蛋白分离以及结构进行了研究，如 Zeng 等6 采用 Osborne 法对莲子蛋白进行分离，并采用傅里叶变换红外光谱(FTI)和紫外可见光
4、谱(UV)对分离蛋白进行了结构解析。另有研究者分析了湘莲等莲子蛋白的组成结构以及氨基酸特性，并对莲子蛋白进行了物理与酶法的改性处理7-8。Zhang 等9 综述了莲子的营养成分、生理功能及加工，并详细介绍了有关莲子蛋白的不同研究成果。目前，有关莲子中不同蛋白的研究报道较少，因而深入研究不同莲子蛋白的氨基酸组成结构以及热特性有助于了解莲子蛋白的分子特性，为研究莲子蛋白多尺度结构与功能特性间的构效关系提供科学依据。1材料与仪器1.1材料与试剂(1)材料:莲子，福建闽江源绿田实业投资发展有限公司。(2)试剂:NaOH、HCl、无水乙醇，天津致远化学试剂有限公司;磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、考马斯亮蓝 G
5、250/250 等(均为分析纯)，购自国药集团化学试剂有限公司。1.2主要仪器SQP 型电子分析天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;FE 28 pH 计:梅特勒-托多利仪器(上海)有限公司;L8900 全自动氨基酸分析仪，日立高新技术公司;K-Alpha X 射线光电子能谱仪，美国Thermo Fisher Scientific 公司;DSC 214 差示扫描量热仪，德国耐驰仪器公司;TG 209F3 热重分析仪，德国耐驰仪器公司。2方法2.1莲子分离与分级蛋白的制备2.1.1莲子分离蛋白的制备莲子磨粉过筛得莲子粉加去离子水0.5 mol/L NaOH 调 pH 至 9.04 000 r/
6、min 离心8 min收集上清液0.5 mol/L HCl 调pH 至4.94 000 r/min 离心8 min收集沉淀复溶水洗至中性真空冷冻干燥莲子分离蛋白(LSPI)。2.1.2莲子分级蛋白的制备参考 Sun 等 10 的方法并修改。莲子磨粉过筛得莲子粉加去离子水4 000 r/min离心 10 min收集上清液(莲子清蛋白，LSA)、沉淀加 NaCl4 000 r/min 离心 10 min收集DOI:10.19870/ki.11-3716/ts.20221012.00246中 国 食 物 与 营 养第29 卷上清液(莲子球蛋白，LSGlo)、沉淀加 70%乙醇4 000 r/min离
7、心 8 min收集上清液(莲子醇溶蛋白，LSP)、沉淀0.5 mol/L NaOH 调 pH 至9.04 000 r/min离心10 min收集上清液0.5 mol/L HCl 调 pH 至4.9离心4 000 r/min 离心8 min复溶水洗至中性真空冷冻干燥莲子谷蛋白(Lotus Seed Glutein，LSGlu)。2.2氨基酸测定精确称取50 mg 莲子蛋白样品于水解管中，加入 10mL HCl，1 g 苯酚进行酸水解，充氮封管后，密封条件下在110 烘箱中水解24 h。水解完成后取出冷却，加去离子水定容到50 mL，混合均匀后吸取1 mL 到小烧杯中，在烘箱中60 脱酸蒸干处理，
8、加适量超纯水溶解，重复蒸干 1 2 次后加入样品稀释液复溶，震荡混匀，0.22 m 滤膜过滤，采用 L8900 全自动氨基酸分析仪进行蛋白质氨基酸组成的分析11。2.3X 射线光电子能谱测定采用 X 射线光电子能谱测试莲子蛋白样品，干燥处理，以 A1 Ka X(1 486.6 eV)射线源为激发源，发射电压12 kV，电流3 mA，束斑直径0.5 mm，全扫描通道能量100 eV，窄扫描通道能量20 eV。2.4DSC 测定根据 Jing 等 12 的方法加以修改，精确称量 1 mg 莲子蛋白样品置于 DSC 铝盘中，空铝盒作为对照。N2保护，N2流速40 mL/min13-14。样品升温扫描
9、范围为 30 260，升温速率10 /min。2.5TG 热重测定准确称取10 mg 莲子蛋白样品，升温区间:30 600 15-16，升温速率:10 /min，N2保护并控制流速:50mL/min，记录水分含量、热分解速率峰值温度、质量变化过程17。2.6数据处理各组试验数据均重复 3 次，P 0.05 被认为数据之间具有显著差异;研究结果采用 Origin 8.5 作图，光谱图采用自带软件进行分析。3结果与分析3.1氨基酸分析氨基酸的组成与比例决定了蛋白的营养质量。表 1显示，必需氨基酸含量占氨基酸总量的(E/T)37.22%42.87%，亮氨酸含量占比最高(15.11%25.39%)，且
10、大多为疏水氨基酸;非必需氨基酸与必需氨基酸之比(E/N)为 59.29%75.04%，含量占氨基酸总量的(N/T)57.13%62.79%，谷 氨 酸 含 量 占 比 最 高18.42%25.91%;支链氨基酸含量占氨基酸总量的(B/T)18.83%19.91%。表1莲子蛋白必需氨基酸、非必需氨基酸组成(g/100 g 蛋白质)氨基酸LSPILSALSGloLSPLSGlu组氨酸(His)1.7981.4651.5651.7011.649苏氨酸(Thr)2.2652.4651.9892.2872.013赖氨酸(Lys)2.5652.6492.7982.4122.246缬氨酸(Val)2.232
11、2.7773.0362.8512.798蛋氨酸(Met)1.2651.0461.4441.3331.316亮氨酸(Leu)2.7984.6565.3234.6514.046异亮氨酸(Ile)3.4652.2642.7982.8502.989苯丙氨酸(Phe)2.1322.4652.0132.1542.416精氨酸(Arg)3.4653.7984.1324.0974.216必需氨基酸(EAA)18.52019.78720.96620.23919.473总氨基(TAA)43.20050.62156.04854.37452.224EAA/TAA(%)42.8739.0937.4137.2237.29
12、谷氨酸(Glu)5.0327.9897.1656.7866.032丝氨酸(Ser)2.2323.4654.7984.2933.798精氨酸(Arg)3.4653.7984.1324.0974.216甘氨酸(Gly)1.7982.0324.1663.5592.798酪氨酸(Tyr)2.0652.6563.1323.3363.499丙氨酸(Ala)2.2652.1652.4472.5613.132脯氨酸(Pro)2.0322.4652.7983.1843.465半胱氨酸(Cys)1.3261.0322.5462.2652.013天冬氨酸(Asp)4.4655.2323.8984.0543.798非
13、必需氨基酸(NEAA)24.68030.83435.08234.13532.751总氨基酸(TAA)43.20050.62156.04854.37452.224NEAA/TAA(%)57.1360.9162.5962.7862.71EAA/NEAA(%)75.0464.1759.7659.2959.46注:测试中以色氨酸(Trp)为评价指标，不列出色氨酸含量(表2 同);LSPI 为莲子分离蛋白、LSA 为莲子清蛋白、LSGlo 为莲子球蛋白、LSP 为莲子醇溶蛋白、LSGlu 为莲子谷蛋白;组氨酸、精氨酸为半必需氨基酸莲子蛋白的 E/T、E/N 比值与 FAO/WHO 提出的必需氨基酸占总氨
14、基酸的比值为40%、必需氨基酸与非必需氨基酸的比值为60%以上的参考蛋白模式相符且部分含量高于参考比值18，说明莲子蛋白氨基酸组成与含量均衡，具有在食品加工中综合利用的潜能。由表 2 与图1 可知，非极性氨基酸含量占比 35.24%38.61%;不带电荷的极性氨基酸含量占比 19.35%25.13%;疏水性 氨 基 酸 及 芳 香 族 氨 基 酸 含 量 占 比 33.45%36.16%。通过以上数据表明，在莲子各蛋白中，谷氨酸的含量均占比最高，表明含有较多带负电荷的非极性氨基酸基团。此外，谷蛋白、醇溶蛋白中所占疏水性氨基酸较多，而清蛋白、球蛋白、分离蛋白中所占亲水性氨基酸较多，这种组成差异与
15、莲子蛋白的溶解度等理化功能特性密不可分。第2 期孙乾等:不同莲子蛋白氨基酸结构与热特性研究47表2莲子蛋白极性与非极性氨基酸组成形式(g/100 g 蛋白质)氨基酸LSPILSALSGloLSPLSGlu非极性缬氨酸(Val)2.2322.7773.0362.8512.798脯氨酸(Pro)2.0322.4652.7983.1843.465丙氨酸(Ala)2.2652.1652.4472.5613.132亮氨酸(Leu)2.7984.6565.3234.6514.046异亮氨酸(Ile)3.4652.2642.7982.8502.989苯丙氨酸(Phe)2.1322.4652.0132.154
16、2.416蛋氨酸(Met)1.2651.0461.4441.3331.316占 TAA 比(%)37.7435.2435.4336.3538.61不带电荷甘氨酸(Gly)1.7982.0324.1663.5592.798苏氨酸(Thr)2.2652.4651.9892.2872.013丝氨酸(Ser)2.2323.4654.7984.2933.798酪氨酸(Tyr)2.0652.6563.1323.3363.499占 TAA 比(%)19.3520.9825.1324.7823.18疏水性氨基酸丙氨酸(Ala)2.2652.1652.4472.5613.132缬氨酸(Val)2.2322.7773.0362.8512.798酪氨酸(Tyr)2.0652.6563.1323.3363.499亮氨酸(Leu)2.7984.6565.3234.6514.046异亮氨酸(Ile)3.4652.2642.7982.8502.989苯丙氨酸(Phe)2.1322.4652.0132.1542.416占 TAA 比(%)34.6233.5533.4533.8536.16带正电赖氨酸(Lys)2.56