1、 Marine Sciences/Vol.46,No.12/2022 159 不同水交换量下皱纹盘鲍转录组测序与分析 周佳峥1,郭永军1,全 峰1,梁 健1,李永仁1,黄亚冬2,梁 爽1(1.天津农学院水产学院,天津 300380;2.天津市海升水产养殖有限公司,天津 300270)摘要:养殖过程的循环水交换量能够显著影响皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)的生理状态,进而影响其养殖存活率和生长率,然而不同循环水量对于皱纹盘鲍的生理状态影响的分子机制尚不明确。本实验以皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)为研究对象,将鲍分别置于循环水交换频率为 1 次/d
2、、2 次/d、4 次/d的条件下(编号为 C0、T2 和 T4 组)暂养 3 d,然后利用 Illumina Hiseq 2500 技术测定不同处理组鲍鱼的肌肉组织中转录组表达情况。结果表明,单次换水组(C0)和多次换水组(T2 和 T4)间差异表达的基因个数较多,分别为 4 095 和 3 617 个,而 T2 与 T4 组之间的差异表达基因个数则较少,仅为 232 个。对差异表达基因进行 GO 和 KEGG 功能分析显示,单次换水组(C0)和多次换水组(T2 和 T4)间差异表达的基因主要集中在能量代谢和免疫反应相关通路或基因,随机选取 10 个差异基因进行荧光定量 PCR 验证,定量 P
3、CR 结果与转录谱结果一致,证实了转录组测序结果的可靠性。本研究说明了更高的水交换量下,鲍的代谢和免疫相关通路被激活,可能有助于鲍鱼维持较好的生理和免疫状态,从而表现出更好的生长、存活等表型。关键词:皱纹盘鲍;水交换量;转录组;能量代谢;免疫 中图分类号:S966.9 文献标识码:A 文章编号:1000-3096(2022)12-0159-10 DOI:10.11759/hykx20201003001 在水产生物养殖过程中,水交换量对养殖生物的生理状态有显著影响。通常情况下,水交换量的增加能够改善生物的生长和存活等状态1-2。例如,在皱纹盘鲍幼鲍的养殖过程中,当水交换量率由流水、24 h/次、
4、48 h/次和 72 h/次逐渐降低时,幼鲍的存活率和增重率也随之下降3。提高水交换量被认为能够显著减少养殖生物在摄食、排泄等过程中产生的氨氮、亚硝酸盐等自污染因子的浓度,同时提高溶解氧、透明度等指标,从而使水生生物维持一个较好的生理状态,最终改善其生长、存活情况等4-5。例如,研究换水频率对刺参养殖水质的影响时发现,日换水率由 0、10%、20%、30%、100%逐步提高时,刺参养殖水体中的氨氮和亚硝酸盐的浓度逐渐降低2;当换水频率为 10 d/月时,则能维持优良的刺参池塘养殖环境6。转录组分析能够了解特定条件下生物体内不同基因的表达情况,从而解析生物在生长发育过程中或外界环境因子影响下,其
5、体内的生长发育、抗逆应激等相关基因的反应情况7-9,目前已被广泛用于研究水产动物的生理功能(如水产动物毒理学、发育生物学、系统进化生物学等)及免疫功能(包括病毒病、细菌病、寄生虫病免疫生物学)等研究10-11。转录组技术在研究水体自污染物质(氨氮、亚硝酸盐等)对水产动物的胁迫效应时也有应用12。例如,氨氮胁迫下的日本沼虾转录组结果显示,胁迫前后有 887 个基因呈差异性表达,且主要富集在 16 条免疫相关通路中,如补体和凝血级联、T 细胞受体信号通路、Toll样受体信号通路与 B 细胞受体等通路13。本课题组过去的研究发现,水交换量的变化能够显著影响皱纹盘鲍的成活率、摄食率和耗氧率情况,具体表
6、现为:随着水交换量由 1 次/d 提升到 收稿日期:2020-10-03;修回日期:2020-11-09 基金项目:天津市种业科技重大专项(19ZXZYSN00080);天津市自然科学基金(18JCQNJC84500);广东省水产健康安全养殖重点实验室开放基金(GDKLHSA0806);2020 年天津市大学生创新创业项目(202010061010);2020 年现代农业产业技术体系建设专项资金(CARS49)Foundation:Tianjin Seed Industry Science and Technology Major Project No.19ZXZYSN00080;Tianji
7、n Natural Science Foundation,No.18JCQNJC84500;Guangdong Key Laboratory of Aquatic Health and Safety Aquaculture Open Fund,No.GDKLHSA0806;Tianjin University Student Innovation and Entrepreneurship Project in 2020,No.202010061010;Modern Special Fund for Construction of Agricultural Industrial Technolo
8、gy System,No.CARS49 作者简介:周佳峥(1999),男,本科生,水产养殖学专业,E-mail:;梁爽(1989),男,通信作者,博士,讲师,主要从事贝类养殖生理生态研究,E-mail: 160 海洋科学/2022 年/第 46 卷/第 12 期 4 次/d,鲍的存活率和摄食量均逐渐提高;且随着水交换量的提高,鲍的耗氧率逐渐降低,1 次换水组的鲍耗氧率(0.470.05)mg/(gh)显著高于 4 次换水组(0.370.05)mg/(gh);相应地,1 次换水组的水体溶解氧量则小于 4 次换水组。此外,水交换量提升降低了鲍养殖水体中的氨氮、亚硝酸氮等自污染因子的浓度14。然而,
9、水交换量变化影响鲍生理状态的分子机制尚不明晰。本文拟采用转录组测序的手段,研究皱纹盘鲍在不同水交换量的条件下,其肌肉组织内转录本表达变化,以阐明不同水交换量对于皱纹盘鲍的生理状态影响的分子机制,为皱纹盘鲍养殖条件的优化提供理论支撑,为贝类健康生态养殖的理论奠定基础。1 材料与方法材料与方法 1.1 材料材料 实验所用的皱纹盘鲍,引自福建晋江某养殖公司。壳长(2.240.30)cm,壳宽(1.440.21)cm,壳高(1.320.19)cm。低温空运至天津。实验前进行 7 d的暂养,暂养条件为盐度 33、pH 7.8、温度(241)。暂养期间按皱纹盘鲍体质量的 1%投喂鲍配合饲料。暂养期间每天早
10、晚全量换水,并及时清除死鲍以及残饵粪便,实验前 24 h 暂停投喂饵料。1.2 方法方法 1.2.1 不同水交换量处理不同水交换量处理 试由上述驯养的群体中,随机取 180 只皱纹盘鲍,平均分成 3 组,平均分配于 9 个 100 L 的 PVC 养殖箱中,按换水频率分为 1 次每天组、2 次每天组、4 次每天组(每天全量换水 1 次、2 次、4 次,每组3 个平行),每个换水组实验持续 3 d,实验期间无鲍鱼死亡。1.2.2 样品取样样品取样 换水实验结束后,从每个换水处理组中的 PVC整理养殖箱中各取 9 只鲍(每个平行箱 3 只),对其进行肌肉组织的取样:使用已灭菌并去除 RNA 酶的剪
11、刀、镊子剪取 100 mg 左右的肌肉组织,放入干净的冻存管中,然后迅速放入液氮中速冻,之后转移至80 冰箱保存。1.2.3 RNA 提取提取 对保存的组织进行液氮研磨,充分研磨后使用Trizol 法15提取各换水组鲍鱼肌肉组织的总 RNA。对每个换水组的 9 个 RNA 样品进行三三等量混合,每组建立 3 个平行 RNA 混合样品。各混样总 RNA利用 Aligent 2000、Nanodrop、琼脂糖凝胶电泳 3 种方法进行浓度及纯度检测。1 次每天组、2 次每天组、4 次每天组的混合样本分别标记为 C0、T2 和T4。1.2.4 转录组测序及分析转录组测序及分析 转录组的建库及测序工作委
12、托北京百迈克生物科技有限公司完成,每个换水组的鲍建立 3 个平行的转录组测序文库(共建库 9 个)并进行测序 Illumina 2000 双端建库测序。获得原始测序序列(Sequenced reads)后,进行以下生物信息学分析:Clean Data的分析;Unigene 的拼接和功能注释;Unigene 功能注释,包括与 NR、Swiss-Prot、KEGG、COG、KOG、GO和Pfam数据库的比对进行;Unigene库基因结构分析主要包括 SSR 分析、CDS 预测和 SNP 分析;不同样品中的基因进行基于 FPKM 的表达量分析;基于基因在不同样品中的表达量,DEseq 识别鉴定差异表
13、达基因;对差异表达基因进行模式聚类、GO 功能注释以及 KEGG 富集分析。1.2.5 荧光定量荧光定量 PCR 验证验证 从转录组结果里随机选取 10 个差异基因进行qRT-PCR 验证,根据所挑选的差异表达基因的序列,遵循引物设计的原则,使用引物设计软件 Beacon designer 7 设计两对定量引物。经标准曲线法测定引物的扩增效率,保证各定量引物的扩增效率类似,且在 95%105%范围内。以上述反转录合成的 cDNA为模板,-actin 基因为内参16,在荧光定量 PCR 仪上进行定量 PCR 反应。反应体系包括:1 L 的 cDNA模板(10倍稀释),各1 L的上下游引物(10p
14、mol L-1),10 L 的 2DNAmo ColorFlash Master Mix(Thermo,USA),以及 8 L 的灭菌超纯水。反应程序设置为:95 7 min,(95 20 s,60 60 s)35,72 10 min,每个反应后均检查熔解曲线以确保产物单一性,每个反应均设置 3 个重复。2 结果与分析结果与分析 对 9 个样品进行 Illumina 2000 双端建库测序,共得到 207 435 516 条原始测序序列,测序正确率高达99.9%。对原始测序序列进行质量筛选,即截除 Reads中的测序接头、引物序列和低质量值数据等,共获得61.81 Gb Clean data,
15、其中各样品GC含量在46.60%47.76%之间,Q30碱基百分比不小于94.39%,表明测序数据完整性好,质量高(表 1)。Marine Sciences/Vol.46,No.12/2022 161 表 1 样品测序数据质量评估 Tab.1 Quality of the sample sequencing data 样品名 读数 碱基数目 GC 含量 Q30 C01 24 462 637 7 271 953 224 47.16%94.55%C02 21 052 272 6 274 674 986 46.99%94.55%C03 23 012 897 6 858 209 710 47.76%9
16、4.58%T2-01 25 628 312 7 642 332 424 47.42%94.62%T2-02 22 402 887 6 683 127 884 47.32%94.55%T2-03 23 422 409 6 984 838 288 47.35%94.55%T4-01 22 574 962 6 729 302 456 46.99%94.79%T4-02 23 079 636 6 875 625 770 47.18%94.45%T4-03 21 799 504 6 492 486 544 46.60%94.39%将得到的所有 Unigene 序列分别与七个数据库对比,比对结果如表 2 所示,可知在 COG、GO、KEGG、KOG、Pfam、Swissprot、eggNOG 七个数据库中成功注释的 Unigene 数量分别为 6 518、7 750、9 116、12 139、15 772、11 014、16 863,最终总共获得 20 480 个至少在一个数据库中有注释信息的Unigene。其中长度大于等于 1 000 的 Unigene 数为16 025 个,长度介于 300