1、 年第 卷第 期，地 球 与 环 境 不同无机氮源对微藻 同化的影响 以蛋白核小球藻为例孙 涛，吴沿友，吴沿胜，方 蕾，周 英，童成英，张开艳（中国科学院地球化学研究所 环境地球化学国家重点实验室，贵阳；中国科学院大学 北京；贵州师范大学 喀斯特研究院，贵阳）摘 要：碳循环和氮循环一直是全球变化领域的研究焦点，水生生物作为水环境物质循环的主要驱动者，在水生生态系统中发挥着重要的作用。微藻作为水环境中重要的光合作用单元，其对无机碳的利用机制，无机碳利用途径的定量方法均有报道，但其 同化对不同比例氮源的响应尚不清楚。因此，本研究通过实验室特定营养体系培养实验，模拟重碳酸盐体系，结合双向同位素标记方
2、法研究了不同无机氮源下蛋白核小球藻（模式藻）同化的影响。结果表明：在氮素营养条件一定（）的情况下，不同比例无机氮对蛋白核小球藻的生长有不同的影响，当硝态氮 铵态氮为（少量铵态氮）时，促进了蛋白核小球藻的生长繁殖，但当铵态氮占比增大时，则会抑制蛋白核小球藻的生长繁殖；不同比例的无机氮对蛋白核小球藻 同化也具有不同的影响，随着铵态氮占比的不断增大，蛋白核小球藻藻体的碳氮比会不断下降且趋于稳定，同时蛋白核小球藻对添加的 的利用份额也不断降低；微藻在生长繁殖时，其碳氮营养的同化相互影响，存在着一种共轭关系。也就是在不同形态氮盐处理时，微藻对添加的无机碳存在着耦合的利用模式。该研究可为微藻碳氮代谢及喀斯
3、特水体环境变化响应的相关研究提供理论依据。关键词：微藻；同化；氮源；铵态氮中图分类号：文献标识码：文章编号：（）：.收稿日期：；改回日期：基金项目：贵州省科学技术基金资助项目（黔科合基础）；国家自然科学基金项目（）；国家重点研发计划课题（）。第一作者简介：孙 涛（），男，硕士研究生，主要研究方向为生物地球化学。：通讯作者：吴沿友（），男，博士，研究员，研究方向为环境地球化学和生物地球化学。：自人类文明进入工业化时代以来，人类活动的影响，如化石燃料的燃烧、森林退化，工业排放等，导致了大气中的二氧化碳含量急剧增加。不仅导致了温室效应，也引起了全球碳循环的变化。与此同时，大量的污染物排入河流、湖泊、
4、水库等地表水体，不但会改变水体的相关理化特性，也影响了一些物质的循环过程，比如氮循环。碳氮循环过程是当前科学界研究的热点问题。而水生生物作为水体物质循环过程的主要载体，在水生生态系统中有着至关重要的作用。水生光合生物在稳碳、固碳中的作用，不仅可以指示喀斯特水体碳汇的相关科学研究，还可以对其他物质（如氮、锌、铁等）的循环过程产生影响。微藻作为水体环境中重要的光合作用单元，通常是指一类生活在水体中，以浮游生活方式为主的微小植物的总称。一般情况下，微藻的光合效率都很高，尽管它们的生物量只占了地球生物圈初级生产者的.，却为整个地球贡献了 的初级生产力。微藻可以利用包括无机氮源和有机氮源的氮素营养。一般
5、情况下，微藻同化的氮素营养主要以无机氮为主。世纪 年代末，稳定碳同位素便开始应用于土壤碳循环研究，之后迅速推广。作为一种优秀的研究工具，稳定同位素技术近年来更是在全球尺度的生态系统物质循环和全球生态变化领域大放异彩。因此，利用稳定碳同位素技术来研究微藻碳氮同化变得尤为重要。研究表明，在短时间尺度上，由于硅酸盐的风化速率较低，碳酸盐风化才是陆地水生生态系统的主要风化碳汇，占岩石风化碳汇的。这使得喀斯特地表水生生态系统成为了重要的研究对象。地 球 与 环 境 年喀斯特水体中，微藻对其生态特性有着独特的适应机制，对无机碳有着独特的利用策略。溶解无机碳（）浓度越高，水生光合生物量越多，生物生长越快，存
6、在“施肥效应”。受 施肥效应的影响，蓝绿藻等浮游植物生物量的增多可能导致水体向富营养化方向发展。在独特的喀斯特环境下，微藻对无机碳的利用机制、碳源碳汇的调节作用、无机碳利用途径的定量方法均有报道，研究表明微藻利用 占所利用的总无机碳的份额随添加浓度变化而变化，总体来看其利用重碳酸盐份额随着添加碳酸氢钠浓度的增大而变大，但过高浓度的碳酸氢钠对其利用重碳酸盐的能力具有抑制作用。微藻对于 的同化会受到无机氮的影响，微藻对不同的无机氮源的响应机制如何？这个科学问题亟待研究。迄今，微藻 的同化对不同比例无机氮源的响应也鲜有报道。因此，本研究通过实验室特定营养体系培养实验，模拟重碳酸盐体系，结合双向同位素
7、标记方法研究了蛋白核小球藻 利用对不同比例氮源的响应。该研究可为微藻碳氮共轭代谢及水体环境变化响应的相关研究提供理论依据。材料与方法.材料藻种：蛋白核小球藻（，），藻种为种群数量占绝对优势的较纯藻种，购于中国科学院水生生物研究所的淡水藻种库（，）。培养基：培养基，配比如表 所示。其中碳源和氮源根据实验条件改进。表 为培养基中 组份的配比和浓度。表 配比 的 培养基所需母液的组份、浓度及用量 ，编号组份母液浓度用量 柠檬酸铁氨 .表 的组份配比及浓度 组份浓度 （）.实验设计 培养基中的氮素营养约为.，为了便于实验培养基的配置和实验条件的控制，本研究将培养体系中的氮素营养设置为 。实验设置 种不
8、同比例氮源，即硝态氮铵态氮摩尔比为、和 。碳源的碳同位素值分别是（组）和（组），培养体系的碳素营养为 的碳酸氢钠。分别双向培养研究不同比例氮源对蛋白核小球藻生长繁殖和无机碳同化的影响，实验均设置 次重复。培养地点在中国科学院地球化学研究所环境地球化学国家重点实验室的无菌培养温室。培养条件：光照强度，（）；光暗周期，；温度，.。调节培养基初始 在.。为保持实验的稳定和准确，接种极少量（培养基仅接种 原藻种液离心浓缩洗涤后的藻种）相同数量藻种，接种后培养基蛋白质浓度均值为.，培养 天，不断进行继代培养保持微藻旺盛的生长状态。.分析测定方法.微藻生物量的测定 根据微藻的生长特性，生物量的指标用微藻培
9、养液蛋白质含量和微藻培养液叶绿素 的浓度来表征。具体测定方法采用考马斯亮蓝比色法和热乙醇紫外分光光度法，测量误差均为系统误差。.稳定碳同位素的测定 微藻有机碳的分离纯化：将培养后的微藻样品分组离心收集，加入适量 盐酸洗涤以去除无机碳的影响，再用超纯水洗涤微藻 次后，用冷冻干燥机充分干燥微藻样品并利用玛瑙研钵将固体粉末样品充分研磨后备测。固体 粉 末 样 品 使 用 气 体 同 位 素 质 谱 仪（）测定其 值，标准品采用国际标准物质（，）。测量误差小于 第 期孙 涛等：不同无机氮源对微藻 同化的影响 以蛋白核小球藻为例.，其结果表示为：（）（样品 标准）（）式中，样品表示样品种的 和 的比值；
10、标准表示标准物质中 和 的比值。.碳氮含量和碳氮比的测定 对测定碳含量和氮含量的样品分开预处理。碳含量测定：将培养后的微藻样品分组离心收集，加入适量 盐酸洗涤以去除无机碳的影响，再用超纯水洗涤样品 次后，用冷冻干燥机充分干燥并利用玛瑙研钵将微藻固体粉末样品充分研磨后备测。氮含量测定：为了避免盐酸洗涤对微藻有机氮含量产生影响，需用超纯水洗涤微藻 次，用冷冻干燥机充分干燥微藻样品并利用玛瑙研钵将微藻固体粉末样品充分研磨后备测。微藻固体粉末样品使用元素分析仪（）测定样品的碳氮元素含量，仪器误差在.以内。选用 盐酸洗涤后的样品测定碳元素含量和未用盐酸洗涤过的样品测定氮元素含量，并计算微藻样品的 值。图
11、 不同比例氮源对蛋白核小球藻的蛋白质（）和叶绿素（）含量的影响 （）（）结果与讨论.两组实验生物量表征数据相关性检验 由于两组实验采用相同的无机氮处理，故对两组实 验 的 蛋 白 质 浓 度 及 叶 绿 素 浓 度 结 果 用.数据分析软件做相关性检验。检验结果如表 所示。结果表明，两组实验组中的结果相关性显著，即不存在显著性差异。故而，下文中的研究结果及讨论内容对 两组实验的相关数据合并处理。表 两组实验相关性检验结果 数据组别蛋白质浓度（）.叶绿素 浓度（）.研究结果.不同无机氮源比例对微藻生长的影响 在氮素营养条件一定的情况下，不同无机氮源比例处理下各组中藻液蛋白质含量和叶绿素含量会随着
12、培养基中无机氮源比例的变化而变化（图）。图 中，硝态氮：铵态氮为 处理组为对照组，表示 硝态氮营养下蛋白质浓度表征的生长状况。对照组蛋白质表征的种群数量增值倍数为 倍左右。当硝态氮：铵态氮摩尔浓度比为时，藻液中蛋白质浓度和对照组相比增加不显著。而当硝态氮：铵态氮摩尔浓度比为 时，蛋白质浓度与对照组相比显著下降。当培养基铵态氮的浓度增加到 （硝态氮铵态氮摩尔浓度比为）时，藻液中的蛋白质浓度进一步下降。这说明在氮素营养条件一定的情况下，随着铵态氮氮源占比增大，藻液中蛋白质浓度会下降，蛋白核小球藻增殖的生物量会下降。图 中，硝态氮：铵态氮摩尔浓度比为 处理组为对照组，表示 硝态氮营养下藻液叶绿素 浓
13、度表征的生长状况。当硝态氮：铵态氮摩尔浓度比为 时，藻液中叶绿素 浓度与对照组相比显著增加。而当硝态氮：铵态氮摩尔浓度比为 时，藻液中叶绿素 浓度显著减少。当培养基铵态氮的浓度增加到 地 球 与 环 境 年（硝态氮：铵态氮摩尔浓度比为 ）时，与硝态氮浓度高的实验组相比，藻液中叶绿素 的浓度是显著减少的。结果表明，在氮素营养条件一定的情况下，蛋白核小球藻种群数量在低于 值时，少量铵态氮的添加会增强藻体中叶绿素 的合成。但当铵态氮占比进一步增大时，会对蛋白核小球藻中叶绿素 合成和种群增长繁殖产生抑制作用。.不同氮源比例对微藻碳含量、氮含量和碳氮比的影响 在氮素营养条件一定的情况下，蛋白核小球藻固体
14、样品的含碳量、含氮量以及碳氮比会随着培养基中无机氮源比例的变化而变化（表）。结果表明，随着铵态氮氮源占比的不断增大，微藻藻体的碳含量从.增加到.后趋于稳定，微藻藻体的氮含量从.增加到.后趋于稳定。利用微藻藻体的碳含量和氮含量计算出其碳氮比。结果表明，微藻藻体碳氮比显著下降后并趋于稳定。已知原始藻种的碳氮比为.，当氮源为硝态氮时，藻体碳氮比为.，这表明对照组中碳氮比符合正常生长的预期。当硝态氮：铵态氮的摩尔浓度比为 时，藻体碳氮比为.，基本符合正常生长的预期。而当硝态氮：铵态氮的摩尔浓度比为 和 时，即铵态氮占比为 或 以上，碳氮比会显著下降。由于含碳量增加的幅度与含氮量增加的幅度不相称，导致了
15、碳氮比的显著下降。表 不同比例氮源对蛋白核小球藻含碳量、含氮量和 值的影响 ，硝态氮铵态氮（摩尔浓度比）碳含量 氮含量 .不同氮源比例对微藻 同化的影响 根据气体质谱同位素方法测定的同位素数据和双向同位素示踪原理模型估算得到蛋白核小球藻在该实验条件下 的利用份额（表）。两端元同位素混合模型可以表示为：（）（，）（）表 各组藻体有机碳同位素值及估算的碳酸氢根利用份额 组 组 利用份额（）.在方程（）中，为微藻藻体的 值，为假定微藻完全利用空气的无机碳源时藻体的 值，为假定微藻完全利用添加的无机碳源时藻体的 值，为微藻利用添加的无机碳占总碳源的份额。对于添加的两种标记的 来说，方程（）可以分别如下
16、：（）（）（）（）在方程（）和（）中，和 分别为添加第一种或第二种已知 的 培养的微藻藻体的 值，为假定微藻完全利用空气的无机碳源时藻体的 值，和 分别为假定微藻完全利用添加的第一种或第二种 时藻体的 值，和 分别为微藻利用添加的第一种或第二种 占总碳源的份额。在联立以上两个方式求解的过程中，不论添加哪种标记的碳酸氢根，只要在同一 浓度等培养条件下，同一种微藻利用添加的 所占总碳源的份额是相同的，其生长参数也是没有显著性差异的，由此可以得到：。由方程（）和方程（）得到：（）（）（）公式（）中（）可以换算成添加的同位素标记 和 的差，进一步简化方程为：（）（）（）根据方程（）和添加的两种 的 值和其对应的处理组的微藻藻体的 值估算出微藻利用添加的 占总碳源的份额。结果表明（表），随着铵态氮氮源占比的不断增大，组中微藻藻体的 从.增加到.，组中微藻藻体的 从.减少到.。不同无机氮处理条件对微藻藻体的 影响显著。表中 表示估算的 利用份额。对照组中（当氮源均为硝态氮时），利用份额约为.。第 期孙 涛等：不同无机氮源对微藻 同化的影响 以蛋白核小球藻为例当硝态氮铵态氮的摩尔浓度比为 时，利用份