1、生物工程 食品科学 2023,Vol.44,No.04 177贝莱斯芽孢杆菌1-3产表面活性素的纯化、鉴定及表征张 军1,2，张 良1，汤 伟1,3，孙晓雯1,2，唐 涛1,3，乔晓妮1,2，梁 萌4，何增国2,3,*（1.中国海洋大学医药学院，山东 青岛 266000；2.青岛百奥安泰生物科技有限公司，山东 青岛 266000；3.青岛海洋生物医药研究院股份有限公司，山东 青岛 266000；4.山东省饲料兽药质量检验中心，山东 济南 250000）摘 要：从口腔离体牙样品中筛选得到1 株具有抑菌作用的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）1-3。通过硫酸铵沉淀、分子筛层析
2、、薄层层析和基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱检测，确定具有抑菌活性的物质是含有1416 个C的环状脂肽Surfactin，其分子质量分别为1 030.642、1 044.660 Da和1 058.677 Da。通过对分离纯化Surfactin的特征研究，结果表明其具有表面活性剂的功能，对食品加工、医疗卫生、畜禽养殖中常见的病原菌具有抑制作用，其中对单核细胞性李斯特菌（Listeria monocytogenes）ATCC 19115的最小抑菌浓度可达4g/mL。Surfactin对小鼠红细胞在有效抑菌浓度范围内未显示溶血性，且具有良好的热稳定性（20100）和广泛的pH值（2.010.0）适
3、应性，表明其在食品加工、医疗卫生和畜牧养殖中具有良好的应用潜能。关键词：贝莱斯芽孢杆菌；环状脂肽；表面活性素；抑菌Purification,Identification,and Characterization of Surfactin from Bacillus velezensis 1-3ZHANG Jun1,2,ZHANG Liang1,TANG Wei1,3,SUN Xiaowen1,2,TANG Tao1,3,QIAO Xiaoni1,2,LIANG Meng4,HE Zengguo2,3,*(1.School of Medicine and Pharmacy,Ocean Unive
4、rsity of China,Qingdao 266000,China;2.Qingdao Bioantai Biotechnology Co.Ltd.,Qingdao 266000,China;3.Qingdao Marine Biomedical Research Institute Co.Ltd.,Qingdao 266000,China;4.Shandong Center for Quality Control of Feed and Veterinary Drugs,Jinan 250000,China)Abstract:The antimicrobial substances pr
5、oduced by Bacillus velezensis 1-3,a strain with antibacterial activity isolated fromoralsamples,wereseparatedandpurifiedbyammoniumsulfateprecipitation,gelfiltrationchromatographyandthin-layerchromatographyandwereanalyzedbymatrix-assistedlaserdesorptionionization-timeofflight-massspectrometry(MALDI-T
6、OF-MS).Thesesubstanceswereidentifiedassurfactinconsistingofthreecycliclipopeptideswith1416carbonatoms,whose molecular masses were 1 030.642,1 044.660 and 1 058.677 Da,respectively.Surfactin could function as a surfactant andexhibitedgoodantimicrobialactivityagainstcommonpathogenicbacteriainthefood,m
7、edicalandlivestockindustries.Meanwhile,theminimalinhibitoryconcentration(MIC)ofsurfactinagainstListeria monocytogenes ATCC 19115 was 4g/mL.Surfactindidnotshowhemolyticactivityagainstmouseredbloodcellswithintheeffectiveantibacterialconcentrationrange.Itcouldenduretemperaturesat20100andwithstandawidep
8、Hrangeof2.010.0.Hence,surfactinproducedbyB.velezensis1-3hasgreatpotentialforapplicationsinthefood,medical,andlivestockfields.Keywords:Bacillus velezensis;cyclic lipopeptide;surfactin;antimicrobial activityDOI:10.7506/spkx1002-6630-20220326-326中图分类号：Q939 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2023）04-0177-08引文格式：张军,
9、张良,汤伟,等.贝莱斯芽孢杆菌1-3产表面活性素的纯化、鉴定及表征J.食品科学,2023,44(4):177-184.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220326-326.http:/收稿日期：2022-03-26基金项目：广东省重点领域科技计划项目（2020B0202010001）；泰山产业领军人才工程项目（tscy202006017）；青岛海洋生物医药研究院大健康项目（HYJK2021003）第一作者简介：张军（1984）（ORCID:0000-0002-7348-2712），男，工程师，博士研究生，研究方向为抑菌功能的肽类代谢产物。E-mail:*通信作者简介：何
10、增国（1964）（ORCID:0000-0001-8087-0310），男，教授，博士，研究方向为微生物代谢及发酵工程。E-mail:178 2023,Vol.44,No.04 食品科学 生物工程ZHANG Jun,ZHANG Liang,TANG Wei,et al.Purification,identification,and characterization of surfactin from Bacillus velezensis 1-3J.Food Science,2023,44(4):177-184.(in Chinese with English abstract)DOI:10.
11、7506/spkx1002-6630-20220326-326.http:/传统抗菌药物在医疗卫生、食品加工和畜牧养殖业中长期不规范应用导致了耐药性病原菌的产生和蔓延，对人类健康、食品安全和畜牧生产带来了不利影响。因此，发掘绿色、安全的天然抗菌活性产物一直是医疗、食品和养殖业研究热点。世界卫生组织（World HealthOrganization，WHO）也将新型抗菌物质的开发视为解决耐药性病原菌的希望1。自然界中存在种类和数量众多的微生物，在激烈的生存竞争过程中，进化出了诸多抑制其他微生物生长的手段，对这些具有抑菌 作用代谢产物的发掘和研究，可以为对治耐药性病原菌提供新的资源2。芽孢杆菌是自
12、然界中广泛存在的一类微生物，由于所处环境多样且复杂，常蕴含丰富的具有抑菌活性的代谢产物，如脂肽、细菌素等，具有潜在的应用价值3。有报道显示，芽孢杆菌产生具有拮抗作用的代谢产物占总基因组的比例高达5%8%4。贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）是近年来广受关注的一种芽孢杆菌。2005 年B.velezensis首次分离于西班牙南部马拉加贝莱斯河流域，因此命名为B.velezensis5。之后研究发现，其与解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）在理化性质上具有一定的相似性，在分类学上曾一度将其归于B.amyloliquefaciens，之后其命名几经反复，最终
13、在2016年通过全基因组比较，确立其为一个独立的种6-8。B.velezensis来源广泛，在土壤、动植物体内、池塘、海洋中均有发现9。B.velezensis蕴含了多种具有抑菌作用的代谢产物基因，包括脂肽类、聚酮类、环肽类和抗生素类10。因此，B.velezensis作为新型抑菌物质的来源，具有巨大的应用潜力。目前B.velezensis较多作为生防菌应用于种植业4,7，而在医疗卫生、食品加工、畜牧生产和环境修复中的应用较少，可能与大多数B.velezensis来源于土壤环境相关11。因此，为扩大B.velezensis的应用范围，一方面需要丰富其来源，从不同环境中筛选具有生物活性的菌株；另
14、一方面需要深入研究其功能性代谢产物的种类和作用机制。本研究从口腔样品中分离得到1 株具有抑菌活性的B.velezensis，通过对其发酵液中抑菌活性物质的分离纯化，鉴定其结构，并通过抑菌谱、抑菌活性、溶血性等对活性产物的特性进行研究，进而为其在医疗卫生、食品加工、畜牧生产和环境修复领域的应用提供理论基础。1 材料与方法1.1 材料与试剂1.1.1 样品与菌株分离样品采集自中国人民解放军战略支援部队医院口腔科的离体牙样品，置于无菌生理盐水中。绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、霍乱弧菌（Vibrio choler
15、ae）、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、白色念珠菌（Candida albicans）、无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、大肠杆菌（Escherichia coli）均由本研究室分离和保存；副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）ATCC17802、单核细胞性李斯特菌（Listeria monocytogenes）ATCC 19115、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）CICC21605分别购自广
16、东微生物菌种保藏中心、宁波明舟生物科技有限公司和中国工业微生物菌种保藏管理中心。1.1.2 培养基与试剂胰酪胨大豆酵母浸膏肉汤（trypticsoy-yeastextractbroth，TSB-YE）培养基：TSB培养基30g，酵母提取物6g，加水至1 L，121 灭菌15 min；酵母浸出粉胨葡萄糖（yeastextractpeptonedextrose，YPD）培养基：酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，加水至1 L，115 灭菌20 min；LB（Luria-Bertani）培养基、TSB培养基、MH（Mueller-Hinton）培养基和MSR（deMan,RogosaandSharpe）培养基购自青岛海博科技有限公司。葡聚糖凝胶G-50 西安蓝晓科技新材料股份有限 公司；其他试剂均为国产分析纯。1.2 仪器与设备Epoch酶标仪 美国BioTek公司；CR21N冷冻离心机 日本日立公司；ALPHA 1-2Ldplus真空冷冻干燥机 德国 Marin Christ公司；HA99-1蛋白纯化系统 上海沪西分析仪器厂有限公司。1.3 方法1.3.1 菌种筛选将采集的离体牙样品