1、第 43 卷第 1 期2023 年 2 月林产化学与工业Chemistry and Industry of Forest ProductsVol 43 No 1Feb 2023收稿日期:2021-12-13基金项目:中国林科院中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金(CAFYBB2021ZC003)作者简介:颜洋洋(1998)，女，安徽安庆人，硕士生，主要从事天然产物的研究与开发*通讯作者:王成章，研究员，博士生导师，研究领域为天然产物研究与利用;E-mail:wangczlhssina com。doi:10 3969/j issn 0253-2417 2023 01 013不同纯度靛蓝提取
2、物的制备及其抑菌活性研究YAN Yangyang颜洋洋1，张昌伟1，2，李 川1，周 昊1，王成章1，2*(1中国林业科学研究院 林产化学工业研究所;江苏省生物质能源与材料重点实验室;国家林业和草原局林产化学工程重点实验室;林木生物质低碳高效利用国家工程研究中心;江苏省林业资源高效加工利用协同创新中心，江苏 南京 210042;2中国林业科学研究院 林业新技术研究所，北京 100091)摘要:在建立靛蓝含量分析方法的基础上，构建了一种新型高效方法制备高纯度靛蓝，并研究了不同靛蓝粗提物和高纯度靛蓝的抑菌活性。以马蓝叶为原料，通过水提取、加碱打花、酸中和以及氢氧化钠除杂等步骤得到了3 种不同靛蓝质
3、量分数(3 06%、20 13%、22 16%)粗提物样品1 样品3;在此基础上，利用单因素试验和 Box-Behnken 响应面设计法优化葡萄糖还原工艺得到了高纯度靛蓝样品 4;最后，采用牛津杯法比较了 3 种靛蓝粗提物和高纯度靛蓝对黑曲霉、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌活性。结果表明:葡萄糖还原工艺最佳条件为葡萄糖质量浓度25 g/L、NaOH 质量浓度269 g/L、反应温度60 和反应时间30 min;在此最佳工艺条件下，可得到纯度为 96 87%的高纯度靛蓝(样品 4)，并且靛蓝收率高达 76 88%。抑菌实验结果表明:3 种靛蓝粗提物和高纯度靛蓝均对黑曲霉、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌
4、具有抑制效果，且随着样品中靛蓝质量分数的增加，样品对 3 种菌的抑制效果均增加;其抑菌圈直径、最小抑菌浓度(MIC)、最小杀菌浓度(MBC)和半数抑菌浓度(IC50)分别为 9 00 19 69 mm、1 512 mg/L、8 64 mg/L(黑曲霉)和 0 6 448 mg/L，高纯度靛蓝对黑曲霉的抑制作用良好，其 MIC、MBC 和 IC50值分别为 1、8 和0 6 mg/L。关键词:马蓝;靛蓝;纯化;葡萄糖还原;响应面法中图分类号:TQ35文献标志码:A文章编号:0253-2417(2023)01-0104-09引文格式:颜洋洋，张昌伟，李川，等 不同纯度靛蓝提取物的制备及其抑菌活性研
5、究J 林产化学与工业，2023，43(1):104112Preparation of Different Purity Indigo Extracts and Study ofTheir Antibacterial ActivitiesYAN Yangyang1，ZHANG Changwei1，2，LI Chuan1，ZHOU Hao1，WANG Chengzhang1，2(1Institute of Chemical Industry of Forest Products，CAF;Key Lab of Biomass Energy and Material，Jiangsu Province;
6、KeyLab of Chemical Engineering of Forest Products，National Forestry and Grassland Administration;National Engineeringesearch Center of Low-Carbon Processing and Utilization of Forest Biomass;Jiangsu Co-Innovation Center ofEfficient Processing and Utilization of Forest esources，Nanjing 210042，China;2
7、esearch Institute ofForestry New Technology，CAF，Beijing 100091，China)Abstract:On the basis of establishing the analysis method of indigo content，a new and efficient method for the preparation ofindigo with high purity was established，and the antibacterial activities of different crude indigo extract
8、s and high purity indigowere studied Using Baphicacanthus cusia leaves as raw material，three crude extracts samples 1 3 with different indigo massfractions(3 06%，20 13%，22 16%)were obtained by water extraction，stir with alkali，acid neutralization and sodiumhydroxide for impurity removal On this basi
9、s，single factor test and Box-Behnken response surface design method were used tooptimize glucose reduction process for acquiring high purity of indigo sample 4 Finally，oxford cup method was employed tocompare the antibacterial activities of three kinds of crude indigo extracts and high purity indigo
10、 against Aspergillus niger，第 1 期颜洋洋，等:不同纯度靛蓝提取物的制备及其抑菌活性研究105Staphylococcus aureus and Escherichia coliesults showed that the optimal conditions of glucose reduction were glucoseconcentration of 25 g/L，sodium hydroxide concentration of 26 9 g/L，reaction temperature of 60 and reaction time of 30 minU
11、nder the optimum conditions，the purity of indigo could reach 96 87%(sample 4)，and the yield of indigo was 76 88%esults of bacteriostatic experiment demonstrated that the three kinds of indigo crude extracts and high purity indigo had inhibitoryeffect on A niger，S aureus and E coli，and the inhibitory
12、 effects on the three kinds of bacteria increased with the increase ofthe mass fraction of indigo in the samples Moreover，the inhibition zone diameter，MBC values，MIC values and IC50values ofthese extracts were 9 00 19 69 mm，1 512 mg/L，8 64 mg/L(A niger)and 0 6 448 mg/L，respectively The highpurity in
13、digo had a good inhibitory effect on A niger，and its MIC，MBC and IC50values were 1，8 and 0 6 mg/L，respectivelyKey word:Baphicacanthus cusia(Nees)Bremek;indigo;purification;glucose reduction;response surface method马蓝叶为爵床科植物马蓝(Baphicacanthus cusia(Nees)Bremek)的叶或茎叶，为道地中药材，收录于中国药典，具有清热解毒和凉血止血之功效1 3。靛蓝为
14、马蓝叶中主要活性成分，具有消炎抗菌等活性4，在医药、食品等领域有着广泛的应用5 7。目前靛蓝分离纯化一般采用马蓝叶浸泡打靛，靛膏水飞精制青黛，N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、乙酸乙酯、二氯甲烷等有机溶剂萃取以及柱层析分离等方法，这些方法存在操作繁琐、靛蓝收率和纯度低、溶剂耗量和毒性较大造成难以回收以及环境污染等问题8 9。因此，急需寻找一种绿色、高效、简便的方法从马蓝叶中分离制备高纯度靛蓝。天然靛蓝属于非水溶性还原染料，在古老的染布工艺中利用酒糟或草木灰将靛蓝在碱性条件下还原为可溶于水的隐色体盐，隐色体盐能够吸附在被染布纤维上，然后在空气中氧化使隐色体盐氧化为靛蓝。现代工艺主要采用葡萄糖、保险
15、粉、二氧化硫脲等还原剂10 11 将靛蓝还原为靛蓝隐色体盐吸附在纤维上用于染布，但是利用此方法制备高纯度靛蓝的研究鲜见报道。因此，本研究在建立靛蓝含量分析方法的基础上，利用 Box-Behnken 响应面法优化葡萄糖还原工艺来制备高纯度靛蓝，并评价不同靛蓝粗提物以及高纯度靛蓝对黑曲霉、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑制效果，以期为靛蓝的高值化开发利用奠定基础。1实 验1 1原料、试剂与仪器马蓝叶，由贵州小生源生物科技有限公司提供;甲醇(色谱纯)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、靛蓝标准品(98%)、葡萄糖、氢氧化钠，均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)、LB 营养琼脂、
16、马铃薯葡萄糖水、LB 肉汤培养基，均购自青岛高科园海博生物技术有限公司;黑曲霉(Aspergillus niger)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)，均购自国家微生物菌种保藏中心。CBM-10A VP Plus 高效液相色谱(HPLC)仪，日本岛津公司;DF-101S 恒温加热磁力搅拌器，河南省予华仪器有限公司;LXJ-IIB 型低速离心机，上海安亭科学仪器厂;KH5200E 型超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司。1 2靛蓝含量分析方法的建立1 2 1HPLC 分析色谱条件YMC-AC-ODSA 色谱柱(250 mm 4 6 mm，5 m)，流动相为甲醇-水体积比 73，进样量 20 L，检测波长 600 nm，流速 1 mL/min。1 2 2对照品溶液的制备精密称取靛蓝标准品 5 mg，置于 100 mL 棕色容量瓶中，加 DMF 至刻度线下 3 4 cm，超声波处理使其溶解，并用 DMF 定容，作为靛蓝储备液。1 2 3供试品溶液的制备精密称取样品 5 0 mg，置于 100 mL 棕色容量瓶中，加