1、分子机制研究套路（一）蛋白翻译后修饰- SUMO化课题：SUMO化A蛋白对B转录因子介导的C信号通路的调控1概念介绍：蛋白质是生命活动中各种功能的执行者,其功能正常与否决定着生命活动能否有序、高效的进行，而其中蛋白质翻译后修饰起着至关重要的作用。蛋白质翻译之后,翻译后修饰改变了蛋白质中氨基酸残基上的生物化学官能团,进而改变其化学性质或结构,使得蛋白质具有更为复杂的结构,更为完善的功能,更为精细的调节。蛋白质的翻译后修饰过程极其复杂,已知的翻译后修饰种类有20多种。但其中较为常见的主要是泛素化、磷酸化、乙酷化、SUMO化、甲基化以及糖基化。类泛素（Small Ubiquitin-like Mod
2、ifier, SUMO)化修饰作为一种重要的翻译后修饰方式对蛋白质的功能有广泛的调节作用,主要包括调节蛋白质的细胞定位,蛋白质之间的相互作用以及蛋白质的活性等方面。据研究报道,在对SUMO化修饰的目的蛋白进行分析之后,SUMO化修饰主要发生在保守序列KXE中的赖氨酸位点K上。表示脂肪族氨基酸,更倾向于亮氨酸L、异亮氨酸I、缴氨酸V。2示意图：SUMO化修饰过程与泛素化类似,包含E1活化酶,E2结合酶和E3连接酶三个酶的级联反应。SUMO在最初合成时是一种前体形式,像泛素一样,需要蛋白剪切酶进行活化加工,形成能够结合到底物赖氨酸上的异构肽键。在啤酒酵母中,这一过程的剪切酶为Ulpl。C端成熟的S
3、UMO首先由SUMO活化酶E1所活化,E1是异二聚体蛋白复合物,由Uba2和Aosl所组成。活化过程需要ATP的参与,通过SUMO腺苷中间体将SUMO与Uba2上的半胱氨酸残基通过硫酯键连接起来。活化后的SUMO接下来被转移到SUMO结合酶E2 Ubc9的半胱氨酸残基上，SUMO连接酶E3结合并催化SUMO连接到底物蛋白上。不同的SUMO化修饰底物有不同的SUMO连接酶E3, 而Ubc9则能够与各种底物蛋白相结合。去SUMO化修饰反应是由具有异构酶活性的Ulpl和Ulp2蛋白所执行的。SUMO连接酶E3主要有三大家族:PIAS、RanBP2和PC2，他们都能与Ubc9相互作用促进 SUMO化修
4、饰。图：SUMO化修饰与去SUMO化修饰循环3研究思路：3.1 A蛋白与B转录因子间相互作用的确定33.1.1在cell-1细胞中A蛋白和B转录因子间存在相互作用33.1.2 A蛋白和B转录因子相互作用的进一步确证（外源表达）43.1.3 A蛋白和B转录因子在cell-1细胞中的分布（免疫荧光，共定位）43.1.4 A蛋白激活B转录因子介导的下游靶元件xxx报告基因活性43.1.5A蛋白对B转录因子的转录激活具有剂量依赖性53.1.6A蛋白被干扰后抑制B转录因子的转彔激活能力53.2A蛋白的SUMO化修饰研究53.2.1A蛋白 SUMO化的确定53.2.2A蛋白 SUMO化位点的确定63.2.
5、3A蛋白的SUMO化位点突变体降低了其转录活性63.2.4 SENP1作为A蛋白的去SUMO化酶抑制A蛋白的转录活性73.2.5 SUMO化影响了 A蛋白在细胞中的定位73.3A蛋白的SUMO化影响了其与B转录因子间的相互作用83.3.1 A蛋白 SUMO化位点突变体降低了其与B转录因子间的相互作用83.3.2 SENP1降低了 A蛋白与B转录因子间的相互作用83.4 A蛋白的SUMO化增强了其对B转录因子的辅激活能力83.4.1A蛋白的SUMO位点突变体降低了其对B转录因子的辅激活能力83.5 SUMO化A蛋白促进cell-1细胞C信号通路的激活93.5.1 SUMO化A蛋白增强了B转录因子
6、下游靶基因E的转录水平93.5.2A蛋白促进cell-1细胞的增殖93.1 A蛋白与B转录因子间相互作用的确定3.1.1在cell-1细胞中A蛋白和B转录因子间存在相互作用据文献报道，A蛋白可能是B转录因子的一个辅助激活因子，因此首先通过免疫沉淀方法研究二者之间是否可发生相互作用。选择内源性同时表达A蛋白和B转录因子的细胞系cell-1，将经过D刺激处理后的细胞裂解液中加入A蛋白抗体或同源免疫球蛋白IgG (阴性对照)进行沉降,用B转录因子抗体进行免疫印记，结果表明二者具有相互作用。注释：1）免疫沉淀试验需要双方向共同验证，即：还需要加入B转录因子抗体或同源免疫球蛋白IgG (阴性对照)进行沉
7、降, 用A蛋白抗体进行免疫印记，结果需与前述一致。2）D刺激是可以使B转录因子被激活的外源性刺激，可以是药物、细胞因子、低温、高盐等条件。3.1.2 A蛋白和B转录因子相互作用的进一步确证（外源表达）为进一歩验证A蛋白与B转录因子间的相互作用,接下来在cell-2细胞内（最好为A蛋白或B转录因子阴性者）通过外源转染带有HA标签的B转录因子和Flag标签的A蛋白,检测二者在cell-2细胞中受D刺激后是否存在相互作用。以Flag标签抗体沉淀A蛋白,然后用HA标签抗体印迹B转录因子，进一步证实 B转录因子与A蛋白间确实存在相互作用。3.1.3 A蛋白和B转录因子在cell-1细胞中的分布（免疫荧光
8、，共定位）前面的实验虽然证明了 A蛋白和B转录因子在cell-1及cell-2细胞中都有相互作用,但二者是否在细胞中共定位还是未知。免疫荧光结果显示不受D刺激时二者虽主要分布于细胞核，但是并不共定位，D刺激后A蛋白和B转录因子可以很好的共定位于细胞核,为它们的相互作用提供了空间上的支持。注释：免疫沉淀和免疫荧光共定位均是研究蛋白与蛋白相互作用的常用方法，但是由于这两种方法单独使用时均有局限性，一篇完善、严谨的paper需同时采用2种方法辅助证明。3.1.4 A蛋白激活B转录因子介导的下游靶元件xxx报告基因活性通过前面的实验证实了 A蛋白与B转录因子在cell-1及cell-2细胞中均存在相互
9、作用,并且在D刺激的情况下,在细胞核内存在很好的共定位。因此,这为A蛋白成为B转录因子的辅因子提供了可能。接下来,通过下游靶元件xxx-luc报告基因质粒进行报告基因实验。xxx-Luc报告基因质粒是一个融合质粒,与萤火虫荧光素酶基因连接。因此当报告基因系统中转染入B转录因子质粒后,B转录因子与ERE元件结合,并激活后者的表达,通过测定荧光素酶活性来反映下游靶元件xxx被激活的情况,从而反映出B转录因子的转录活性。在转入B转录因子的同时再转入A蛋白质粒,就可检测A蛋白对B转录因子的转录活性的影响。结果显示：当A蛋白和B转录因子同时转染后，在D刺激下，xxx 的转录活性显著上升。3.1.5A蛋白
10、对B转录因子的转录激活具有剂量依赖性对cell-1细胞转染xxx-Luc报告基因质粒、B转录因子和不同量的A蛋白 (l00 ng，250 ng，500ng)。结果显示，在D刺激下，随着A蛋白转入量的增加，A蛋白对B转录因子的辅激活能力逐渐增强。从上述实验可以看出，A蛋白能够增强B转录因子的转录活性，同时这种激活作用在D刺激的作用下具有剂量依赖性。3.1.6A蛋白被干扰后抑制B转录因子的转彔激活能力上面实验证明在D存在情况下，A蛋白的过表达促进了B转录因子的转录活性,接下来通过干扰RNA降低内源A蛋白的表达,进一步检测内源A蛋白表达下降对B转录因子转录活性的影响。结果显示A蛋白表达的抑制在D刺激
11、存在时可降低B转录因子的转录活性。注释：当使用siRNA干扰对靶蛋白进行敲减时，由于siRNA有脱靶的可能性，需要针对每个基因设计3对siRNA，至少需要有2条可以成功敲除靶蛋白。3.2A蛋白的SUMO化修饰研究3.2.1A蛋白 SUMO化的确定Cell-1细胞经D刺激后裂解收样，细胞裂解液中加入A蛋白抗体进行沉降,用SUMO-1抗体进行免疫印记。结果显示在cell-1细胞内A蛋白可以被SUMO-1修饰,并且随着D刺激时间的延长，A蛋白的SUMO化水平逐渐增强。为进一步确定A蛋白能被SUMO化修饰,在cell-2细胞中共转染Flag-A蛋白与Myc-SUMO-1 ,再次进行免疫共沉淀实验。在细
12、胞裂解液中分别加入IgG(对照组)或Flag抗体(实验组)进行沉降,用Myc抗体进行免疫印记，再次确证 A蛋白是一个SUMO化蛋白。3.2.2A蛋白 SUMO化位点的确定SUMO蛋白对底物的修饰通常发生在其Lys残基上，通过生物信息学分析，确定出A蛋白 2个可能的SUMO化修饰位点,即Kaa1和Kaa2 。（aa，amino acide）为确定预测的A蛋白的SUMO化位点是否为其修饰位点，分别构建Flag-A蛋白 Kaa1R、Flag-A蛋白 Kaa2R、Flag-A蛋白 2K/2R质粒（将2个赖氨酸位点单独或同时突变为精氨酸位点），在cell-2细胞中分别转染了 Flag-A蛋白或其突变体，
13、以及Myc-SUMO-1。结果显示，当SUMO-1与Flag-A蛋白 Kaa1R或Flag-A蛋白 Kaa2R共转染时，与SUMO-1与Flag-A蛋白共转染时的SUMO化修饰条带相比明显减弱；但当SUMO-1与Flag-A蛋白 2K/2R共转染时,几乎检测不到A蛋白的SUMO化条带。因此， A蛋白 Kaa1和Kaa2为A蛋白的SUMO化修饰位点。注释：关于蛋白质氨基酸位点的突变，具体突变为哪种氨基酸，以不改变原有蛋白的三维结构为原则。通常情况下，赖氨酸突变为精氨酸，二者均为碱性氨基酸，且侧链结构相似。3.2.3A蛋白的SUMO化位点突变体降低了其转录活性通过报告基因实验检测A蛋白的SUMO化
14、位点突变体对其自身转录活性的影响。首先,我们利用Flag-A蛋白及3个SUMO化位点突变体的质粒,将GAL4-DBD片段插入到上述载体中,构建了 GAL4-DBD- A蛋白，GAL4-DBD- A蛋白Kaa1R，GAL4-DBD-A蛋白Kaa2R和GAL4-DBD-A蛋白2K/2R。GAL4-DBD-A蛋白质粒为融合质粒，前端为酵母转录因子Gal4的DNA结合区域(DNA Binding Domain, DBD)，后衔接A蛋白,而对应的萤火虫荧光素酶报告基因质粒的启动子上则带有能与该DBD区域特异识别的元件。因此当向报告基因系统中转染入这种A蛋白质粒后,表达的融合蛋白能结合到荧光素酶报告基因质
15、粒的启动子上并激活后者表达,通过检测荧光素酶活性的变化,即可反映出A蛋白转录活性的变化。实验结果显示，与空白对照相比，当DBD-Luc与GAL4-DBD-A蛋白共转染后,可明显激活Luc的表达；当与GAL4-DBD-A蛋白Kaa1或Kaa2R共转时,Luc的活性有所降低；当与GAL4-DBD- A蛋白2K/2R共转染时，其活性进一步降低。3.2.4 SENP1作为A蛋白的去SUMO化酶抑制A蛋白的转录活性SUMO化修饰是一个动态的过程，当SUMO对底物蛋白修饰完成后，需要在特定的SUMO蛋白酶(SUMO-specific proteases, SENPs)作用下，使SUMO蛋白从底物上游离出来
16、，从而进行下一轮的修饰。哺乳动物细胞中共有6种去SUMO化酶的存在， 即SENP1、SENP2、SENP3、SENP5、SENP6和SENP7。其中SENP1、SENP2、SENP3主要分布在细胞核中,而A蛋白发挥转录功能主要在细胞核中， 因此，采用SENP1-3进行报告基因实验，以确定何种SENP对A蛋白的影响最大。对细胞转染DBD-Luc、GAL4-DBD-A蛋白、Flag-SENP1/2/3或Flag-SENP1/2/3mut (SENP1/2/3的去SUMO蛋白酶活性突变体)，结果显示当转入GAL4-DBD-A蛋白时可明显增强Luc的活性，而当同时转入Flag-SENP1时,其活性下降
17、；而当转入Flag-SENP1mut时，报告基因活性得到恢复。而与Flag-SENP2和Flag-SENP3共转染与只转染GAL4-DBD-CL0CK时相比，对报告基因的活性影响不大。由此可见，SENP1对A蛋白的转录活性具有抑制作用。3.2.5 SUMO化影响了 A蛋白在细胞中的定位SUMO化修饰可通过影响蛋白与蛋白间的相互作用，蛋白的细胞定位等方面，从而影响底物蛋白的功能。为检测A蛋白的SUMO化是否对其细胞定位产生影响，我们进行了核质分离和免疫荧光实验。两种方法结果均显示在没有SENP1存在时， A蛋白主要呈细胞核分布，当外源转染了 SENP1时，A蛋白在SUMO化降低的同时,其在细胞中
18、的分布也发生了明显改变，由细胞核向细胞质转移，主要呈胞质分布。3.3A蛋白的SUMO化影响了其与B转录因子间的相互作用3.3.1 A蛋白 SUMO化位点突变体降低了其与B转录因子间的相互作用在cell-1细胞中分别转染空载体，Flag-A蛋白或Flag-A蛋白2K/2R。用Flag抗体进行沉降,然后用B转录因子抗体进行印记。结果显示，转入Flag-A蛋白可以检测到比较明显的B转录因子条带；而当转入Flag-A蛋白 2K/2R时，没有条带检出。由此可见，A蛋白的SUMO化位点突变体可明显降低A蛋白与B转录因子间的相互作用。3.3.2 SENP1降低了 A蛋白与B转录因子间的相互作用前面的实验证明
19、了 SENP1可作为A蛋白的去SUMO化酶介导A蛋白的去SUMO化。因此，接下来的实验研究 SENP1的加入是否也能降低A蛋白与B转录因子间的相互作用。在cell-2细胞中同时转染 HA-B转录因子、空载体或SENP1或SENP1mut或SUMO-1，转染24小时后收细胞。首先用A蛋白抗体进行沉降，然后用HA抗体进行印记。结果显示，转染SENP1使A蛋白与HA-B转录因子相互作用条带明显减弱，转入SENP 1mut或SUMO-1使得A蛋白与HA-B转录因子的结合得到恢复。3.4 A蛋白的SUMO化增强了其对B转录因子的辅激活能力3.4.1A蛋白的SUMO位点突变体降低了其对B转录因子的辅激活能
20、力Cell-1细胞共转染B转录因子的下游靶元件xxx-luc，B转录因子，和Flag-A蛋白或Flag-A蛋白2K/2R。结果显示，在 D刺激的情况下，可明显增强B转录因子的转录活性，当B转录因子与Flag- A蛋白2K/2R共转染时，B转录因子的转录活性有所下降。3.5 SUMO化A蛋白促进cell-1细胞C信号通路的激活3.5.1 SUMO化A蛋白增强了B转录因子下游靶基因E的转录水平对cell1细胞转染B转录因子、Flag-A蛋白或Flag-A蛋白 2K/2R共转染。转染24 h后， D刺激处理一定时间，收细胞，提取总RNA，进行反转录，通过Real-time PCR扩增E基因，以GAP
21、DH为內参。结果显示，当转入Flag-A蛋白时，经D刺激后，E基因的转录水平进一歩增高；而当转入Flag-A蛋白 2K/2R时，D刺激对E基因转录水平的激活作用消失。由此可见，A蛋白对E基因的转录激活作用与其自身的SUMO化相关。注释：E基因为参与C信号通路的成员。3.5.2A蛋白促进cell-1细胞的增殖对cell-1细胞转染空载体，Flag-A蛋白和Flag-A蛋白 2K/2R。转染24h后，D刺激处理一定时间后进行MTT实验。实验结果显示，转入Flag-A蛋白与空白组相比，在D刺激的情况下，细胞增殖量明显提升，而转入SUMO化位点突变的Flag-A蛋白 2K/2R对细胞增殖影响不大。注释
22、：此部分不一定是研究细胞增殖，具体研究何种细胞生物学功能，与B转录因子下游靶基因E等的主要作用有关。除增殖外，还可能是凋亡、周期阻滞、分化、迁移、浸润、转移、血管生成等。4应用案例：1.Li S, Wang M, Ao X, Chang AK, Yang C, Zhao F, Bi H, Liu Y, Xiao L, Wu H: CLOCK is a substrate of SUMO and sumoylation of CLOCK upregulates the transcriptional activity of estrogen receptor-alpha. Oncogene 2013, 32(41):4883-4891.