1、项目类别投送学科代码科学部编码AC030304国家自然科学基金申 请 书 项目名称: 靶向求源探索宫颈癌发病分子学机理 申 请 者：马 丁 所在单位：华中科技大学同济医学院 邮政编码：430030 通讯地址：湖北省 武汉市 航空路13号 电 话：传 真：电子信箱： 申请日期: 2002年3月 国家自然科学基金委员会一九九七年制填 报 说 明 一、填写申请书前，请先查阅国家自然科学基金有关项目申请办法及规定。申请书各项内容，要实事求是，逐条认真填写。表达要明确、严谨，字迹要清晰易辨。外来语要同时用原文和中文表达。第一次出现的缩写词，须注出全称。 二、申请书为十六开本，复印时用B5复印纸，于左侧装
2、订成册。第三页起各栏空格不够时，请自行加页。一式六份（至少一份为原件），由所在单位审查签署意见后，按申报学科投送国家自然科学基金委员会对口科学部。地区科学基金项目，申请书另报送省（自治区）科委一份原件。 三、封面右上角“科学部编号”由对口科学部填写，项目类别和申报学科代码1由申请者填写。 四、下列人员不得作为申请项目的负责人提出申请，但可作为项目组成员参加研究： 在读（含在职）研究生 已离退休的科研人员 申请单位的兼职科研人员 五、申请者和项目组中具有高级专业技术职务的主要成员申请（含参加）的项目数，连同在研的国家自然科学基金项目数（不含重点项目、重大项目），不得超过两项。 六、同一项目组研究
3、内容相近的项目，只允许报送一个学科。 七、申请者可因同类项目竞争等原因，提出不宜评议本项目的专家名单（姓名与单位，3人以内），密封于信封中，钉在申请书原件封面，或另专函相关学科，供科学部选择同行评议人时参考。科学部将对此信息保密。 八、国家自然科学基金委员会通讯地址：北京市海淀区花园北路35号东门 邮政编码：100083一、简表名称逆向求源探索宫颈癌发病分子学机理英语The etiology and molecular biological counterevidence of cervical cancer women研类别A.自由申请B.高技术探索C.青年D.地区高技术探索究E. 重大F.
4、重点H.专项A 项目主题号项报审名称1妇科学名称2A.基础研究目学科代码1C030304 代码2B.应用基础A申请金额2500 万元起止年月2003年1 月至2005年12 月 所用实验室A.国家重点；B.部门开放B实验室编号姓名马 丁性A. 男出生年月民名称汉申拼音Ma Ding别B. 女A身份证号族代码01专业技术名称教授学A. 博 士 B. 硕 士博士学位授予国别 国(地区)名 中国A.院士B.博士生导师请职务代码011位C. 学 士A或地区代 码156C.博士后B名称华中科技大学系(所)同济医院代码43007402 者所在 性质A.高等院校B.科研单位邮政编码430030隶属名称教育部
5、单C.其它A申请者电话(027)83662475关系代码360位所在地 湖北省（自治区、直辖市）武汉市（县) 石乔 口 区 航空街（路）13 号总人数高级中级初级博士后博士生硕士生参加单位数114431 主姓名身份证号专业技术 职 务工作单位及代码项目中的分工签章 1 本项目采用全新科研设计及研究手段，运用双向分子分析验证系统在DNA、RNA和蛋白研摘三个层次全面探索宫颈癌发病机制。研究要点究包括HPV相关致癌基因的筛查和确定、病毒内蛋白表达方式、信号传导调节、致病过程、易容要感度量标准。特别是反向逆源手段不但能精巧和辨别致病蛋白，更能准确追逆确定致病基因，意由此建立针对阻断病毒感染致癌的“治
6、疗窗”义主题词1.主题词不多于三个； 2. 主题词之间空一格(英文用/分隔)中文宫颈癌人类乳头状病毒分子机理英文 Cervical cancer/ HPV/biological mechanism简 表 填 写 要 求一、 简表内容将输入计算机，必须逐项认真填写，采用国家公布的标准简化汉字，简表中所有代码以最新发布的国家自然科学基金申请项目分类目录及代码为准填写。高技术探索课题主题号按高技术新概念新构思探索课题项目指南中主题号填写，申请重点项目时项目类别也填写B，并在申请书封面右上角加注“高技术探索课题重点项目”。二、 凡选择性栏目，将相应提示符A、B等之一填入该栏的右下角。三、 部分栏目填写
7、要求：项目名称应确切反映研究内容和范围，最多不超过25个汉字（包括标点符号）。基础研究指以认识自然现象、探索自然规律为目的，不直接考虑应用目标的研究活动。应用基础研究指有广泛应用前景，但以获得新知识、新原理、新方法为主要目的的研究。申报学科申请项目所属的最基础学科。如涉及多学科可填写两个，先填为主学科。申请金额以万元为单位，用阿拉伯数字表示，注意小数点。起止年月起始时间从申请的次年1月算起。完成时间为完成年度的12月。 所用实验室系指研究项目将利用的实验室仅填写国家计委批准的国家重点实验室或部门批准的开放实室。所在单位名称及代码按单位公章填写全称。例如“中国科学院西安光学精密机械研究所”不得填
8、“中科院西安光机所”或“西安光机所”。全称中的数字，一律写中文，例如：航空航天工业部第七一研究所。首次申请国家自然科学基金的单位，尚未编入单位代码，其代码暂不填写。参加单位数指研究项目组主要成员所在单位数，包括主持单位和合作单位（含作者所在单位），以阿拉伯数字表示。项目组主要成员指在项目组内对学术思想、技术路线的制订与理论分析及对项目的完成起重要作用的人员，本人应在申请书上签名。本栏双线右侧内容不输入计算机。 研究内容和意义摘要及主题词均录入软盘。 2 二、立论依据 （包括项目的研究意义、国内外研究现状分析，附主要的参考文献及出处）对 对基础研究，着重结合国际科学发展趋势，论述项目的科学意义；
9、对应用基础研究，着重结合学科前沿、围绕国民经济和社会发展中的重要科技问题，论述其应用前景。宫颈癌是危害全世界妇女健康的首要恶性肿瘤之一，居女性癌症死亡率第二位1。宫颈癌发病率及死亡率在不同地区、不同经济状况的国家有显著差异。据世界卫生组织报告，发病率最高的国家为智利（15.4/10万），中国(14.6/10万)仅次于智利，都是宫颈癌的高发国家。特别近年来宫颈癌发病率在我国有明显增高趋势，并趋于年轻化2, 3。因此，如何找寻宫颈癌发病因素，探索发病的分子学基础，最终达到根除宫颈癌是关系到攻克重大疾病，保护我国妇女健康的重要课题。宫颈癌发病的高危因素就目前研究资料主要可能为以下因素：(1)人类乳头
10、状瘤病毒(HPV)感染和性因素：约95宫颈癌患者体内可检出HPV。HPV已被视作宫颈癌发病的首要因素4-6。在初次性生活过早（16岁）、性生活活跃、性紊乱和性生活不洁的妇女中宫颈癌发病率高。性因素被认为引导致癌因子HPV 、巨细胞病毒(CMV)等的入侵而具备的，宫颈癌作为一种性传播性疾病已普遍被认同。(2)宫颈病变：宫颈慢性疾病如宫颈中重度糜烂、慢性子宫颈炎、宫颈息肉、宫颈湿疣、产后裂伤等与宫颈癌发生有关联，实际上宫颈慢性病变给HPV等致癌因子更多的侵入机会。(3)基因改变：细胞遗传学研究发现，宫颈癌细胞存在非随机性染色体异常，如第1、3、5、11和17号染色体上有等位基因缺失7。(4)激素：
11、糖皮质激素、类固醇激素如雌孕激素等可以增强病毒转录。(5)免疫状态： 某些HLA基因型在宫颈癌患者中较正常人更为常见，表明宫颈癌易感性可能部分由调节对HPV免疫反应的先天遗传因素所决定8。吸烟者、肾移植患者易患宫颈鳞癌，可能与免疫功能缺陷有关。由于机体免疫功能下降，清除病毒能力亦下降，导致病毒持续感染状态。上述五点高危因素实际上或多或少都与HPV感染有关9。 探索宫颈癌发病过程中的分子生物学因素是国内外学者关注的课题，特别在HPV与宫颈癌发病关联方面进行了先期研究。HPV亚型繁多，约100多种，其中约有20种与人类生殖区皮肤粘膜病变有关，根据其对生殖系统致癌危害性又分为“高危组”和“低危组 ”
12、。低危组有HPV6、11、40、42等，主要引发良性增生如尖锐湿疣；高危组有HPV16、18、31、33、51等，常引起恶性转化5。HPV结构为一小的双链病毒，其基因组可分为三部分。就目前初步研究认为，第二部分早期区包含6个开放阅读框，E1、E2、E4、E5、E6和E7，它们 3-1在病毒复制时起重要作用。其中E6、E7编码的癌蛋白可能对病毒复制及HPV感染的宿主细胞的转化十分关键2,3， E1蛋白具有ATP酶活性，对于病毒的复制亦很重要，而E2蛋白能与调控区下游区(URR)结合充当转录活化或抑制因子。HPV 的DNA在宿主细胞中以两种方式存在，一种是整合状态，另一种是染色体外的附加体形式。在
13、癌前组织中病毒常位于染色体之外，而在癌细胞中，病毒DNA以单拷贝或多拷贝串联方式整合于宿主细胞DNA中，结果导致E2基因缺失，E2基因的作用是抑制E6、E7基因启动，从而使E6、E7基因表达异常最后表现为细胞增长失控。另外，HPV在宿主细胞染色体中整和似乎是随机的2,3,7。在某些细胞株中正是这种整合发生在已知的致癌基因附近，因而也可能由于HPV的整合，激活了细胞癌基因，引起细胞恶性转化10。上述初步研究尚在探索阶段。宫颈癌作为危害中国妇女健康的首要癌肿，是医学生物领域迫待研究攻关的课题。在过去一段时期，经过许多学者的努力，已初步了解到HPV与宫颈癌发生可能的内在关系，这为病毒诱导基因突变最终
14、导致癌肿这一重要观点提供了理论基础11, 12。但由于受探索思维和技术条件的限制，对病毒诱发肿瘤机制的根本内涵仍不甚了解，特别是HPV感染诱发促进宫颈癌发生的关键环节尚仅只能根据有限的资料进行推测, 更不能解释以下急待澄清的问题：(1 )HPV感染与宫颈癌发生的“时空径限”和“强频度径限” ；(2) HPV亚群感染与宫颈癌类别的关联；(3) HPV在宿主细胞染色体中的整和方式； (4) HPV如何维持持续恶性表型；(5) HPV关键癌变基因片段的定位以及相应病毒蛋白功能表达的关建所在； (6)HPV致癌蛋白致使p53及Rb产生无效调节的内在联系；(6) 癌变关键调节环节以及相应可能的阻断措施1
15、3,14。以上要点对揭示宫颈癌发病机理和分子学基础是至关重要的。本项目采用新的科学探索思维、新的研究手段，运用生物芯片技术在DNA、RNA和蛋白三个层次全面系统探索宫颈癌发病机制，研究要点包括HPV相关致癌基因的筛查和确定、病毒蛋白在宿主细胞的表达方式、信号传导调节过程、易感频度和强度的度量标准。本课题将采用双向分子验证分析系统，旨在探索宫颈癌发病的分子生物学原理，一方面运用正向追综手段，即基因芯片差异显示方法筛选出目标基因，进而追综相应蛋白在致病过程中的功能演变；另一方面采用逆向求源方法，即二维蛋白解析方法和蛋白芯片差异显示手段确定致病蛋白，反向逆源找出致病基因。众所周知，任何病理过程的分子
16、基础都包含DNA、RNA和蛋白的变异表达， 但DNA的变异不一定最终有RNA或蛋白的差异表达，而蛋白的差异表达就一定有RNA和DNA变异的存在。因此，逆向求源方法从分析致病蛋白的 接第3页（项目的研究意义、国内外研究现状分析，附主要的参考文献附页） 3-2 差异表达达和功能演变着手，采用全新技术路线，精巧准确对致病蛋白进行分辨定格，并以此为切入点追逆解译DNA的变异，为病毒感染、病毒蛋白致癌提供确实可靠的依据，也可为探索其它疾病与致病因素相互关系建立一个新的技术突破口。在以上研究的基础上，提出针对病毒感染致癌的 “治疗窗”，建立终止HPV持续感染状态、保护妇女免受宫颈癌侵扰的策略及有效方法。参
17、考文献1. Chan PK, et al.Determinants of cervical human papillomavirus infection: differences between high- and low-oncogenic risk types. J Infect Dis 2002 1;185(1):28-352. Schoell W, et al. Epidemiology and biology of cervical cancer. Semin Surg Oncol. 1999; 16:203-2113. 马丁，奚玲. 宫颈癌的流行病学及病因学研究进展. 中国实用妇产
18、科杂志. 2001; 23:1-54. 许雪梅, 司静懿等. 中国山东地区妇女宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16E6E7基因的分离、克隆和序列分析. 中国医学科学院学报. 1999; 21:185-191 5. Combita AL, et al.Serologic response to human oncogenic papillomavirus types 16, 18, 31, 33, 39, 58 and 59 virus-like particles in colombian women with invasive cervical cancer. Int J Cancer 2002 2
19、0;97(6):796-8036. Hagensee ME, et al. Infection with Human Papillomavirus: Update on Epidemiology, Diagnosis, and Treatment. Curr Infect Dis Rep 2000; 2(1):18-24 7. Reinstein E, et al.Degradation of the E7 human papillomavirus oncoprotein by the ubiquitin-proteasome system: targeting via ubiquitinat
20、ion of the N-terminalresidue Oncogene 2000;19:5944-50 3-3 8. Daemen T, et, al.Immunization strategy against cervical cancer involving an alphavirus vector expressing high levels of a stable fusion protein of human papillomavirus 16 E6 and E7. Gene Ther 2002;9(2):85-94 9. Natale C, Computer-assisted
21、analysis of molecular mimicry between human papillomavirus 16 E7 oncoprotein and human protein sequences. Immunol Cell Biol 2000;78:580-510. Villa LL,et al. Molecular variants of human papillomavirus types 16 and 18 preferentially associated with cervical neoplasia. J Gen Virol 2000;81 Pt 12:2959-68
22、11. von Knebel Doeberitz M.New molecular tools for efficient screening of cervical cancer. Dis Markers 2001;17(3):123-812. Boyle P,et al. Update on cancer control in women. Int J Gynaecol Obstet 2000;70(2):263-30313. Daemen T, et, al.Immunization strategy against cervical cancer involving an alphavi
23、rus vector expressing high levels of a stable fusion protein of human papillomavirus 16 E6 and E7. Gene Ther 2002;9(2):85-94 3-4三 、 研究方案1. 研究目标，研究内容拟解决的关键问题研究目标1) 通过研究HPV感染与宫颈癌发生的内在关系和分子生物学基础, 阐明肿瘤发生学中作为重要外源促发因素的病毒致癌机理。2) 从DNA、RNA和蛋白三个层次全面探索宫颈癌发病机制，特别以病毒致癌蛋白的结构定格和功能研究作为切入点，逆向求源解译病毒癌基因。3) 确定病毒蛋白在宿主细胞
24、的表达方式、信号传导调节过程、易感频度和强度的度量标准。4) 提出针对病毒感染致癌的 “治疗窗”，建立终止HPV持续感染状态、保护妇女免受宫颈癌侵扰的策略及有效方法。研究内容1) 从整体水平，筛查宫颈癌高危人群，观察慢性宫颈病变与HPV易感状态的时空窗，确定HPV感染时机、频度、强度的度量关系。2) 从细胞水平，分离建立宫颈正常细胞、易感细胞及宫颈癌细胞株,在体外培养过程对比观察细胞生物学、细胞形态学的特征。3) 从分子水平，采用双向验证法探索宫颈癌发病的分子生物学原理，一方面运用正向追综手段，即基因芯片差异显示筛出目的基因，进而追综相应蛋白在致病过程中的功能演变；另一方面采用逆向求源方法，即
25、二维蛋白显示和蛋白芯片确定致病蛋白，反向逆源找出致病基因，研究要点包括:(1) HPV相关致癌基因的筛查和确定；(2) 病毒致癌蛋白功能结构的鉴定；(3) 外源病毒转导致癌蛋白产物在宿主细胞的表达方式、信号传导调节过程、易感频度和强度的度量标准；(4) 调控网络相关活性因子的变化。 4-1拟解决的关键问题：1. 研究HPV感染诱发宫颈癌的分子学基础，精确分 析病毒致癌蛋白功能结构，运用双向验证法特别是逆向求源手段准确筛查病毒癌基因DNA片段。2. 探索HPV在宿主细胞的整合方式，细胞内信息或效应因子作用的病理性累积强化效应。3. 明确病毒DNA不同开放编码的过度表达或缺失对影响病毒复制、激活宿
26、主细胞癌基因、维持恶性表型的关键所在。4. 探讨HPV病毒蛋白在肿瘤恶变进程中与p53、Rb相互结合过程及对细胞生长负调节功能的影响。5. 阐明端粒酶激活及调控与高危型HPV感染的相互关系，p53和Rb对端粒酶活性的调节作用机制。6. 以全新微电子蛋白分析手段确定致癌基本元素以及致癌的根本规律，明确病毒诱促发癌变的触发点，进一步找寻超早期阻断HPV诱发宫颈癌的“时间窗”。 4-2 2. 拟采用的研究方法，技术路线，实验方案及可行性分析 研究方法，技术路线，实验方案1） 筛查比较慢性宫颈慢性疾病、宫颈癌前病变、宫颈癌的病变特点与HPV感染关系：(1) 计算机智能(Pepnet)筛查上述三类病变细
27、胞涂片；(2) 电子阴道镜观察病变特点；(3) 检查各类病变HPV感染状态，分析HPV各亚群与特定宫颈病变的相互关系(PCR和荧光免疫方法)。 2) 宫颈癌细胞HPV致病DNA正向示踪分析：(1) 分离克隆宫颈癌细胞的表达差异DNA(对照正常周边组织细胞) ；(2) 抑制性消减杂交技术和差异显示PCR筛查；(3) RT-PCR合成相应mRNA并通过荧光标记制成生物探针；(4) 应用PCR单链构象多态性分析法(PCR-SSCP)和PCR杂合双链分析法(PCR-HA)检测可能诱发的突变基因； a) 通过PCR-SSCP法在中性聚丙烯酰胺凝胶上分析DNA的二级结构的变化，从而显示相应小片段碱基的改变
28、；b) PCR-HA法采用异源杂合双链错位配处手段分析相应同源双链DNA的迁移率，进而显示突变片段；(5) 应用表达谱基因芯片杂交分析待查基因在宫颈癌细胞的差异表达，进而阐明基因功能； (6) 分析鉴定相应蛋白在组织细胞中的差异表达。 3) 宫颈癌细胞HPV致病蛋白逆向求源分析：(1) 宫颈癌组织细胞致癌相关蛋白一级分析: 应用Western Blot和原位杂交粗筛差异表达蛋白；(2) 宫颈癌组织细胞致癌相关蛋白二级分析: 应用二维蛋白显示(Protein 2-D eletrophoresis) 对一级分析筛选的目标蛋白进行精细分带，与对照组织细胞表达蛋白进行差异分析；(3) Raman光谱分
29、析：样品经特殊处理进行Raman光谱分析，利用特征振动谱带信息指认蛋白的功能基团的成份及活性、蛋白质二级结构(a-Helix、b-sheet Radon Coil及C=O、C+N伸张、N-H弯曲指认和归属等)，以此弄清差异表达蛋白的功能基团和蛋白质二级结构。 5-1 (4) 宫颈癌组织细胞致癌相关蛋白三级分析: 挑选经二级分析鉴定的目标致癌蛋白进行荧光标记，将其与共价离子蛋白芯片结合，经计算机距阵分析译出致癌蛋白多肽结构和相应DNA核苷酸序列；(5) 宫颈癌组织细胞致癌相关蛋白四级分析: 当目标致癌蛋白与共价离子蛋白芯片结合后，使用特功酶对芯片上的蛋白进行特殊分解（Digest on chip
30、），再进一步经计算机距阵分析译出致癌蛋白多肽结构和相应DNA核苷酸序列；(6) 对经四级分析鉴定蛋白的理化、生化性质进行精细分析。4) 病毒致癌蛋白分子生物特性分析：（1） 蛋白质活性离体测定；（2） 致癌蛋白与细胞培养测定；（3） 致癌蛋白与组织培养测定；（4） 观察病毒致癌蛋白与宿主细胞生长调节蛋白间的关系。 5) 病毒致癌分子调控机理分析：(1) 流式细胞仪分析宿主感染细胞的表型及组织相容性表现；(2) 运用分子原位杂交和共聚焦激光断层显示系统观察病毒在宿主细胞中的整合时机及方式；(3) 观察细胞周期调节因子p53和Rb蛋白 对慢性宫颈慢性疾病、宫颈癌前病变的保护作用；(4) 测定各类病
31、变细胞病毒蛋白与、p53、Rb及E2F-1水平，观察病毒致癌蛋白对p53和Rb蛋白可能的负调节作用；(5) 探索分析端粒酶激活与HPV感染的内在关系，端粒酶各组份（hTR或hTERT）的活性表达内涵，以及p53和Rb失活、端粒酶激活和细胞恶性转化的机制；(6) 测定各类病变细胞中活性调控因子如-干扰素、-转化生长因子和表皮生长因子受体的表达活性以及病毒致癌蛋白的相互关系。 6 ) 根据研究结果，提出整体的、分层次有效阻断病毒致癌综合方案及策略：(1) 利用精筛鉴定的致癌蛋白制备高效免疫疫苗，接种保护高危人群；(2) 应用分子基因治疗手段对已感染人群，干预逆转病毒持续致癌状态。 5-2研究方法，
32、技术路线，实验方案流程图 5-3 可行性分析:1） 本项目采用多学科、多项新技术的综合性研究，可保证各项指标的全面完成。2） 申请单位在中国最早建立妇科肿瘤专科研究室，并承当 “八五”、“九五”中国妇女生殖系统病毒感染流行学攻关课题。申请者长期从事妇科肿瘤研究，有深厚肿瘤基础研究的功底。3） 已建立本项目涉及的实验模型，以及实施本项目关键性的技术条件和实验方法，如Pepnet检测系统、流式细胞分析系统、共聚焦组织细胞分析系统和DNA、RNA及蛋白分析手段。4） 项目组高、中、初级科研人员结构合理，课题组成员技术实力雄厚，多人曾承担并完成国家各级别科研课题，有较强的科研履约能力和良好的履约记录。
33、5） 申请单位已具备完成课题所需的绝大部分仪器设备，如DNA合成仪、PCR仪、流式细胞议、共聚焦分析仪。今年已策划投资500万建立生物芯片检测研究中心。6） 申请单位已在去年为本项目先期课题“宫颈癌早期智能筛查系统” 提供18万配套启动基金，并承诺为本项目提供配套基金。7） 已同美国西南医学中心Anderson癌症中心及德国Essen大学建立合作关系，部分实验将在美国西南医学中心实验室进行。3 本项目的创新之处1） 本课题以探讨研究HPV感染与宫颈癌发生的分子机理为切入点，旨在揭示肿瘤发生、发展的基本规律，找寻可能的阻断措施，抢占国际肿瘤分子生物学制高点。2） 申请者在广泛调研和自身实践的基础
34、上，在国际上率先提出双向分子验证分析系统和新技术工艺路线，对HPV致癌基因和相应蛋白的结构功能进行正向和逆向全方位分析。特别是后者聚焦在致癌的基本功能蛋白的解析，以此逆源解译DNA核苷密码，更具创意。3） 对差异表达的功能蛋白所采用的分析手段，如多级分解鉴定、系列酶解分带精确定性、共价离子蛋白芯片杂交、芯片原位蛋白分解等多是首次设计或是最新技术的革新，目的是能够对目标蛋白分辨精细、定位准确、简化省时。4） 该分析系统除探索HPV感染与宫颈癌因果关联外，更普遍适用于从现象到本质、结构至功能基本规律的探索，如生命功能的基本分子结构、药物的有效结构等等，有实质的创新意义。 5-4 4. 年度研究计划
35、及预期进度 本项目预期用三年时间完成, 自2003.1 - 2005.12 2003.1 - 2003.12 完成方法步骤技术路线中第 1)部分中(1)、(2)；第 2)部分中(1)、(2)；第 3)部分中(1)主要关键内容。 2004.1 2004.12 完成方法步骤技术路线中第 1)部分中(3)；第 2)部分中(3)；第 3)部分中(2)、(3)；第 5)部分中(1)、(2)、(3)主要关键内容。 2005.1 2005.12 完成方法步骤技术路线中第 2)部分中(4)、(5)；第 3)部分中(4)、(5)、(6)；第 4)部分中(1)、(2)、(3)、(4) 主要关键内容。完成补充方法步
36、骤技术路线中的其余部分，总结实验结果，撰写论文，课题结题并组织鉴定。5. 预期研究成果成果以论文形式发表并组织鉴定1) 初步明确HPV感染与宫颈癌发生的内在关系和分子生物学基础, 阐明肿瘤发生学中作为重要外源促发因素的病毒致癌机理。2) 确定病毒蛋白在宿主细胞的表达方式、信号传导调节过程、易感频度和强度的度量标准。3) 提出针对病毒感染致癌的 “治疗窗”，建立终止HPV持续感染状态、保护妇女免受宫颈癌侵扰的策略及有效方法4) 研究成果获奖期望值：获国家科技进步成果二等奖一项；并争取国际科技奖项。5) 发表科技论文数量和级别：国外期刊发表论文4篇以上，国内期刊发表论文8篇以上。 6 四、 研究基
37、础1 与本项目有关研究工作积累和取得的研究工作成绩（1） 申请者长期从事肿瘤临床和基础研究，特别在美国西南医学中心工作6年期间，执行NIH共128万基金的研究项目,积累大量第一手科研资料，掌握目前世界上先进的分子生物学技术，国内延续开展工作起点高，溶入较多创新项目。申请者是2000年度国家杰出青年基金获得者，在国内外核心期刊发表40余篇文章，SCI引用160次。（2） 项目组成员一直承担妇科肿瘤专项科研课题和“八五”、“九五”中国妇女生殖系统病毒感染流行病学攻关课题。系统收集了大量宫颈癌和中国妇女生殖系统病毒感染流行学的宝贵资料，已建立了确实可行的现代研究分析工作体系，在实践工作中积累了丰富的
38、研究经验。（3） 项目组近年来已完成“宫颈癌计算机人工智能快速筛查系统的实验和临床研究”获院校科技进步一等奖；“女性生殖道病毒感染的内在影响” 获卫生部科技进步一等奖；“宫颈癌及癌前病变与性传播疾病相关性研究”获湖北省卫生厅一等奖。并正在开展“妇科恶性肿瘤生物芯片诊断系统建立”和“妇科肿瘤分子生物基因工程学”等项相关研究。为本项目奠定坚实基础。（4） 已经建立本项目涉及的实验模型，以及实施本项目关键性的技术条件和实验方法，如Pepnet检测系统、病毒分离检测系统、流式细胞分析系统、共聚焦组织细胞分析系统、DNA损伤(单链及双链损伤)与修复检测技术和DNA、RNA及蛋白分子生物学分析手段，在原有
39、基础上有大的突破与创新，并已取得部分实验基本数据。（5） 本学科具有良好的科研梯队，学科带头人及骨干人员年轻化，绝大多数人员者有国外研修的履历，开创了活跃进的学术气氛和新颖的学术思想。（6） 本研究小组实验组已系统检索了最新相关研究文献资料，本学科有良好的国际合作关系，与美国西南医学中心、MD.Anderson肿瘤中心、德国Essen大学等国外科研机构保持了长期合作关系，以保证本项目的研究进展与国际接轨。 以上情况表明，本课题申请单位具备完成此课题各项研究的坚实基础和雄厚实力，有足够能力按计划圆满完成本项目的研究任务。 7-1 已具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决的途径（包括利用国家重点
40、实验室和部门开放实验室计划与落实情况）申请人领导的“妇科肿瘤研究室”(主任)和参与领导的“分子医学中心”(副主任)“基因治疗研究中心”(副主任)自1996年以来，已投资800多万元购置分子细胞生物学研究设备，包括核酸研究、蛋白分析、细胞培养设施等。已有主要仪器设备(部分)扫描电镜，透射电镜 程序冷冻降温仪 高压液相色谱仪 原位杂交仪单光源、双光源流式细胞仪 悬液制片系统激光共聚焦分析系统(Confocal) 电脑分子核酸分析仪紫外分光DNA 蛋白分析仪 去离子水发生过滤系统石蜡、冷冰、超薄切片机 超声细胞粉碎仪酸碱测定仪 低温超速离心机二氧化碳培养箱 PCR仪恒温孵育摇床 显微成像系统磁微粒检测仪 氨基酸自动分析仪超净工作台 恒温冷柜凝胶分带照像系统 电脑图文处