1、中 国 组 织 化 学 与 细 胞 化 学 杂 志CHINESE JOURNAL OF HISTOCHEMISTRY AND CYTOCHEMISTRY第 31 卷第 6 期2022 年 12 月Vol.31.No.6December.2022收稿日期2022-06-15 修回日期2022-12-08基金项目山西省“四个一批”科技兴医创新计划项目（2020XM32）作者简介丁彩云，女（1988 年），汉族，硕士研究生*通讯作者(To whom correspondence should be addressed)：；成对框基因2蛋白在C57BL/6J小鼠脑发育进程中的表达丁彩云1，蔚洪恩2*，
2、周党侠1*（1西安交通大学医学部病理系，西安 710061；2山西省人民医院神经内科，太原 030012）摘要目的 研究正常 C57BL/6J 小鼠脑发育进程中的组织形态学变化以及成对框基因 2（Pax2）蛋白在胚胎期和出生后脑组织中的表达规律。方法 取 C57BL/6J 小鼠胚胎期 11.5 d、13.5 d、15.5 d 的胎鼠头部和胚胎期 17.5 d、出生后 0 d、7 d、14 d 和 30 d 小鼠的全脑组织进行石蜡包埋，连续矢状位切片后进行 HE 染色和免疫组织化学染色。结果 胚胎期 11.5 d 可见小鼠完整的 5 个脑泡结构，15.5 d 大脑皮质出现 5 层结构，小脑皮质外
3、颗粒层明显可见。出生后各脑区按照时空顺序继续发育，到 P30 大脑皮质和小脑皮质均发育成熟出现典型的结构特征。Pax2 蛋白在脑组织中的表达主要定位于细胞核和神经纤维上，在胚胎期的表达主要集中在脑桥延髓部位且呈弥漫性表达，E13.5 达到高峰，出生后在脑桥延髓的表达逐渐减弱，但在小脑中的表达较胚胎期增强；E13.5 时在小脑内开始少量表达，P7 时达到高峰，P14 后表达量逐渐降低；Pax2 蛋白在外颗粒层中于 E17.5 时开始表达，出生后主要在内颗粒层和髓质中强烈表达，到 P30 时表达减弱，仅分布在内颗粒层中。结论 小鼠脑发育在一定的时空顺序下，经历了一个复杂的过程。Pax2蛋白在小鼠脑
4、组织中的表达呈现出一定的时空变化规律，可能参与小鼠脑桥延髓早期区域化的建立和小脑的发育过程。关键词成对框基因 2；脑发育；免疫组化染色；小鼠中图分类号R365 文献标识码A DOI：10.16705/ki.1004-1850.2022.06.002Expression of paired box gene 2 protein in the developing brain of C57BL/6J miceDing Caiyun1,Wei Hongen2*,Zhou Dangxia1*(1Department of Pathology,Medical Department of Xian Jia
5、otong University,Xian 710061,China;2Department of Neurology,Shanxi Provincial Peoples Hospital,Taiyuan 030012,China)AbstractObjective To study the histomorphological changes in the developing brain of normal C57BL/6J mice and the expression pattern of paired box gene 2(Pax2)protein in the embryonic
6、and postnatal brain tissues.Methods Paraffin-embedded brain tissues from mice at different developmental stages were sagittal and serially sectioned for immunohistochemical staining and HE staining.Results At 11.5 d of embryonic life(E11.5),five intact cerebral vesicle structures were visible.At E15
7、.5,five layers of cerebral cortex appeared,and the external granular layer of the cerebellum was clearly visible.After birth,the brain regions continued to develop in a spatial and temporal sequence,and by P30 both the cerebral cortex and cerebellar cortex had matured and developed typical structura
8、l features.The expression of Pax2 protein in brain tissue was mainly localized in the nucleus and nerve fibers,and the expression of Pax2 protein in the embryonic stage was mainly concentrated in the pontine medulla and was diffusely expressed,with a peak at E13.5.After birth,the expression in the p
9、ontine medulla gradually decreased,but the expression in the cerebellum was en-hanced compared with the embryonic stage.At E13.5,the expression of Pax2 protein in the cerebellum started to be small and peaked at P7,while the expression of P14 and P30 decreased gradually.At E17.5,Pax2 protein express
10、ion appeared in the external granular layer and was strongly expressed mainly in the inner granular layer and medulla after birth,and by P30,Pax2 protein expression diminished and was distributed only in the inner granular layer.Conclusion Mouse brain development undergoes a complex process in a cer
11、tain spatial and temporal order.The expression of Pax2 protein in mouse brain tissue showed a certain spatial and temporal change pattern,which may be involved in the establishment of early regionalization of the pontine medulla and the development of the cerebellum in mice.KeywordsPaired box gene 2
12、;brain development;immunohistochemical staining;mouse中国组织化学与细胞化学杂志546第 31 卷成对框基因（paired box gene）是一组编码转录因子的基因，通常作为关键的调节因子参与胚胎发育过程中的细胞增殖、迁移和特异性分化，对不同组织和器官的早期发育具有重要作用1。人类和小鼠的 Pax 基因家族共有 9 成员，即 Pax192。Pax2作为 Pax 家族中一个重要的成员主要参与肾脏、输尿管、耳及眼等器官的表达3。随着对 Pax2 基因的深入研究，越来越多的证据表明，Pax2 与中枢神经系统的发育密切相关。在人类，发现日本人群中
13、Pax2 相关的障碍病患者可表现出孤独症谱系障碍、语言延迟等发育异常4；婴儿期 Pax2 基因表达异常可出现发育迟缓、智力缺陷以及小头畸形症状5。Pax2 5 号外显子胞嘧啶缺失的患者容易诱发癫痫发作6。在对小鼠的研究中发现Pax2 基因纯合突变的小鼠有脑部畸形表现7。最新的研究也发现Pax2基因缺失的小鼠可表现出以重复刻板行为为主要特征的神经障碍8。由此可见，Pax2基因在人类和小鼠中枢神经系统的发育过程中发挥重要作用。但是 Pax2 基因在中枢神经系统中的发育规律及其导致相关疾病的分子机制仍不太清楚，因此，本研究观察了正常 C57BL/6J 小鼠脑发育过程中的形态学变化及其发育中Pax2蛋
14、白的时空表达情况，为后续研究 Pax2 在中枢神经系统疾病中的作用机制提供理论基础和参考依据。材料和方法1 材料本实验所选用的 C57BL/6J 小鼠均购自山西省人民医院实验动物中心。实验动物的生产许可证号为：SYXK（晋）2019-0003。实验小鼠饲养于山西省人民医院 SPF 级实验动物中心，环境恒温、恒湿，采取 24 h 昼夜节律，自由饮食。本实验已通过山西省人民医院动物伦理委员会批准。2 取材及固定每日下午 17:00 按雄雌 1:2 合笼，次日清晨 8:00和下午16:00进行检栓，发现阴道口有白色或黄色凝固物者为见栓，记为 E0.5，出生第一天记为 P0。分别取 E11.5、E13
15、.5、E15.5 胎鼠头部和 E17.5、P0、P7、P14 和 P30 小鼠全脑组织，放入 4%多聚甲醛组织固定液中固定 24 h 后脱水、石蜡包埋。胎头和脑组织均以 3 m 厚度进行矢状位连续切片。3 HE 染色石蜡切片脱蜡水化：二甲苯 I、II 各 10 min，无水乙醇 I、II95%乙醇 80%乙醇 70%乙醇 蒸馏水各 2 min；苏木素染液染色 10 min，自来水冲洗 10 s；分化液分化 5 s，自来水冲洗 30 s；返蓝液返蓝 1 min，自来水冲洗 30 s；伊红染色 2 min，自来水冲洗 5 s；梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树脂封片。4 免疫组织化学染色采用罗氏全自
16、动多功能组织病理检测系统（BenchMark ULTRA）进行染色。一抗 Pax2（兔单抗，克隆号：EP235）为即用型抗体工作液，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。二抗及检测系统采用 Ventana 公司生产的 OptiView DAB IHC Detection Kit。除一抗外，其余试剂均为罗氏配套的封闭试剂。按照设定好的程序进行染色：石蜡切片脱蜡水化，清洗缓冲液清洗；抗原修复液（ULTRA Cell Conditioning Solution）100 修复 64 min；降到室温后，清洗缓冲液清洗，滴加过氧化物酶抑制剂（OptiView Peroxidase Inhibitor）孵育 45 min；清洗缓冲液清洗后，加兔抗 Pax2 单克隆抗体工作液37 孵育 44 min；清洗缓冲液清洗后，分别加 HQ Linker（OptiView HQ Universal Linker）和 HRP 标记二抗（OptiView HRP Multimer）37 各孵育 12 min；清洗缓冲液清洗后，滴加 DAB 显色剂（0.2%DAB+0.04%H2O2）37 呈色 8 min；依次滴加苏