1、热带林业2023年6 月第51 卷第2 期血叶兰组培苗与内生真菌共生培养的生长效应研究杨泽秀1,陈英转，吴文碟,钟云芳,陈耀丽可2,31.海南珠峰园林科技有限公司，海南海口57 0 2 2 0；2.热带特色林木遗传与种质创新教育部重点实验室海南大学林学院，海南海口57 0 2 2 8;3.福建江南春城市建设集团有限公司，福建漳州3 6 3 0 0 5摘要：从野生血叶兰的根系中分离出6 株内生真菌并接种于血叶兰组培苗进行菌苗共生培养,3 个月后测定血叶兰生长发育指标和瓶苗出瓶后一个半月的移栽成活率。结果表明：(1)在组培苗上筛选出来的6 株对血叶兰均有不同的促生效果菌株，分别为链格孢属（Alte
2、rnaria）菌株G6、炭疽病属（Colletotrichum）菌株G9和Y21、轮层炭菌属（Dal-dinia)菌株G11和Y20、木霉属（Trichoderma)菌株Y6;（2)经过与真菌共生培养的组培苗炼苗的移栽总体效果良好，平均成活率高达9 0.9%。关键词：血叶兰；内生真菌；共生培养；炼苗中图分类号：S682.31Symbiotic Culture Growth Effect of Ludisia Discolor Seedlings and Endophytic FungiYang Zexiu,Chen Yingzhuan?,Wu Wendie,Zhong Yunfang,Chen
3、 Yaoli?.31.Hainan Everest Landscape Architecture Technology Co.,Ltd.of,Haikou Hainan 570220;2.Key Laboratory of Genetics and Germplasm Innovation of Tropical Special Forest Trees and OrnamentalPlants,Ministry of Education/College of Forestry,Hainan University,Haikou Hainan 570228;3.Fujian Jiangnanch
4、un Urban Construction Group Co.,Ltd,Zhangzhou Fujian 363005Abstract:Six endophytic fungi,separated from the root systems of the native Ludisia discolor,were inoculatedagainst Ludisia discolor tissue culture seedlings in flask for symbiotic culture to measure the growth effect ofseedlings after 3 mon
5、ths symbiotic culture and their survival rates,when they had been transplanted in bottlesfor 1.5 months.The studie displayed that,(1)Six endophytic fungi selected from tissue culture seedlings haddifferent promoting effects.Among six endophytic fungi,including one Alternaria species,two Colletotrich
6、umspecies,two Daldinia species,and one Trichoderma species;(2)Through the culture of endophytic,the trans-planting effect of tissue culture seedlings is generally good.After being transplanted,90.9%of plantlets survived.Key words:Ludisia discolor,Endophytic fungi,Symbiotic culture,Seeding基金项目：海口市科学技
7、术工业信息化局重点科技项目（2 0 2 0-0 40）：血叶兰优质种苗繁育及高效栽培技术示范推广。第一作者：杨泽秀（1 9 7 0-）,男，高级项目管理师、林业助理工程师，研究方向为林业,E-mail:。通讯作者：陈耀丽（1 9 8 5-）,女，园林工程师，研究方向为园林,E-mail:。24文献标识码：B繁殖育苗doi:10.3969/j.issn.1672-0938.2023.02.006TROPICAL FORESTRY兰科是高级进化类群，是集药用、观赏和科研作择无污染的组培苗和直径为0.5cmX0.5cm的供试用于一体的植物 1，同时也是十分典型和极具代表真菌菌块，两者同时接种进行菌苗
8、共生，以不接内生性的菌根植物，其菌根的共生真菌是公认人工栽培、真菌的处理作为对照组，每处理重复1 0 次。实验过引种别化、资源再生和保护的重要决定性因子 2 。兰程中细心观察，1 个月后统计实验结果，去除导致苗花的菌根是兰科植物根系与真菌形成的菌根共生畸形的内生真菌，保留有益的菌株用于菌苗共生的体，菌根的营养来源对宿主植物的生活和营养造成培养实验。一定的影响 3 。因此，兰花内生真菌和组培苗共生的1.4内生真菌与血叶兰组培苗共生的筛选研究对兰科的保育、移栽炼苗管理及药用药理开发将1.3 保留完好的菌株活化备用，选择长势一具有重要的意义。致的血叶兰无菌苗，清除根部残留培养基后置于精血叶兰（Lud
9、isiadiscolor)是兰科血叶兰属的多度为千分之一的电子天平上称重，将处理过无菌苗年生草本植物，植株的根茎匍匐生长，茎节形态较为有序接种于经过改良的DE培养基上，每瓶接种4株明显，像蚕一样趴在坚硬的石头上，故也被称为“石血叶兰组培苗。上藕”。血叶兰干燥的植株有安神健脾、治疗食欲选取内生真菌接种于4株组培苗的中间部位，不振等效果。除药用外，还可食用，有益气健身等作每个处理重复1 0 次，以无菌PDA块作为对照组。培用 4-5。近些年研究发现，菌根真菌在带叶兜兰、铁皮养3 个月后记录各处理的无菌苗生长发育的效果，石斛和霍山石斛等兰科植物的研究中均有相关的报实验期间去掉致死或发生畸形的菌株。再
10、培养1 个道，进一步解释了兰科植物和菌根真菌之间关系的月后进行数据的记录，每个处理以随机选择1 0 袋组重要意义 6-7 。目前,因栖息地和生境的破坏,野生血培苗作为一组，测定血叶兰的生根数量、根系长度、叶兰资源正在面临威胁，有些地区甚至面临枯竭，对植株高度等植物生长发育指标，测定不同内生真菌野生血叶兰资源保存的研究刻不容缓。组织培养、实验组和对照组的生长发育指标可作为判断内生真菌根技术及建立菌苗共生体系是实现血叶兰资源菌对血叶兰组培苗效果的重要理论支撑。保存的良好途径。血叶兰近年的研究主要集中在营1.5炼苗培养基筛选养价值、开花物候、内生真菌分离与鉴定和组织培挑选经过菌苗共生，长势一致的健壮
11、组培苗进养 8-1 1,而对血叶兰与内生真菌共生培养的研究少行炼苗实验，温室瓶内组培苗置放约2 d后拧松瓶盖见报道。因此，该研究在无菌血叶兰组培苗上，将经再放2 d，为更好适应外部环境，再将瓶盖完全打开过分离纯化的菌株接种于血叶兰组培苗中，培养2d。经过消毒的无菌镊子小心取出血叶兰无菌苗，洗34个月，定时记录实验组培苗的生长指标，并与净组培苗再用浓度为50%的多菌灵溶液浸泡1 0 min对照组进行比较，筛选菌苗共生的有效培养基，以后微晾干种植在已配好的基质中。基质搭配的比例期建立血叶兰菌苗共生体系，为血叶兰保育、菌根技如表2，设置4种不同基质处理，种植前搅拌均匀，术的研究提供一定的有效途径。并
12、用水拌透，每个处理3 盘，每盘40 株。经过1 个月1 材料与方法的移栽炼苗后，详细记录血叶兰组培苗的存活率以1.1实验材料及生长指标的状态。选择大小和长势一致的无根无菌血叶兰组培苗1.6培养条件和经分离纯化的内生真菌菌株保存备用。恒温2 5条件下培养，光照时间为1 2 h（黑暗时1.2实验培养基间为1 2 h），光照强度控制在1 8 0 0 1 x2 3 0 0 1 x 之间。内生真菌在PDA培养基中纯培养，内生真菌和1.7数据处理组培苗共生则在改良的DE培养基中培养。实验采用Excel2010和SPSS26.0数据分析软1.3内生真菌与血叶兰组培苗的初步筛选件对该实验记录的数据进行汇总以及
13、差异性分析。长势一致的无菌苗，洗净苗根部并接种于DE培2 结果与分析养基中，每处理4株无菌苗，经过1 周培养观察，选2.1内生真菌对血叶兰无菌苗生长指标的影响繁殖育苗25VOL.51 NO.2 Jun.2023热带林业2023年6 月第51 卷第2 期实验在野生血叶兰植株中筛选出的6 6 株内生真菌中，发现大部分的内生真菌能够导致血叶兰组培苗死亡或致病，与血叶兰不能共生培养(图1)。对剩余的6 株菌株进一步筛选，培养3 个月后发现6株菌株在与血叶兰组培苗共生培养中对组培苗的生长发育有一定的促进作用。共生培养G6号菌株1 个月后，其内生真菌的菌丝在培养基上匍匐生长，基本无菌丝的缠绕（图2)，结果
14、如表1。在组培苗鲜重方面，血叶兰与G9（55.0 1%）和Y6菌株（55.1 3%)共生培养的鲜重增长率与对照组（48.2 4%)相比有显著差异,即(P0.05)，血叶兰在G6号菌株中共生培养和血叶兰在对照组中培养的鲜重增长率无显著差异；在血叶兰与G11号、Y20号2 个菌株共生培养中发现其鲜重增长率均显著低于实验对照组。在血叶兰株高的测量中发现，血叶兰经过与G6、G 9 和G11菌株进行共生培养的株高显著高于实验对照组；血叶兰与G11菌株共生培养的茎粗（3.59 cm）显著低于对照组（4.6 2 cm)，血叶兰与其余的内生真菌共生培养的茎粗测量结果均与实验对照组无显著的差异。在血叶兰根数方面
15、，血叶兰与G6菌株共生培养促使血叶兰生根效果较为明显，其生根数（4.40 条）与实验对照组（2.2 0 条)的效果最为突出，血叶兰与Y21号菌株共生培养的生根数低于对照组。在血叶兰根长方面，血叶兰与G11（3.9 4c m）和Y21号菌株3.39cm）共生培养的根长均显著高于对照组(2.84cm）。通过血叶兰组培苗生长发育指标的考量，发现经过G9号内生真菌处理的血叶兰组培苗的生长发育效果优于其他处理组；其中G6号内生真菌属于链格孢属，G9、Y2 1 内生真菌属于炭疽病属，G11、Y20内生真菌属于轮层炭菌属，Y6号内生真菌属于木霉属，说明同属不同种类的内生真菌对血叶兰组培苗的生长发育效果也有所
16、差异。AB60.00150.0040.0030.0020.0010.000.00鲜重增加率株高图2 血叶兰组培苗生长指标的测定Fig.2 Determination of Growth Index of Tissue CultureSeedling of Ludisiadiscolor表1 血叶兰组培苗生长发育指标测定Tab.1 Determination of Growth and Development Index ofTissue Culture Seedlings of Ludisia discolor编号鲜重增长/%CK48.243.97cG650.492.18tcG955.011.
17、37aG1144.63 2.32dY653.13 3.20abY2043.720.68dY2150.56 2.58tc注：表格中的数据为各处理的平均值土标准差，同列不同小写字母表示在P0.05水平上差异显著，下同。2.2基质类型对菌苗共生种植炼苗的影响植物组织培养炼苗移栽成功的关键在于成活率的占比。该实验将血叶兰移栽种植在4种不同基质中一个半月后，发现血叶兰组培苗移栽种植在不同基质类型中的成活率均在8 5%之上（见表2）。其中纯水苔为基质的组培苗成活率为1 0 0%，血叶兰无菌苗根系较为粗壮，植株长势良好（图3）；血叶兰在松树皮+泥炭土基质（9 5.5%）中种植，苗生长整齐，生长发育良好。综上
18、，血叶兰以水苔作为种植基质的移栽效果最好。表2 不同基质对血叶兰炼苗成活率的影响Tab.2 Effects of Different Substrates on the Survival Rateof Ludisiadiscolor Seedling基质配方（配比）成活率/%松树皮：腐殖土(1:1)85.5松树皮：椰糠(1:1)87.5松树皮：泥炭(1:1)90.5纯水苔100.0CK-G6*G9G11-Y6Y20-Y21T茎粗根数株高/cm茎粗/cm7.190.6364.631.219.23 1.69a4.80 1.5189.14 0.75*4.78 1.328.76 0.813.59 0.
19、76b7.210.98b4.850.60g8.170.91ab4.730.538.07 1.82ab4.27 0.75ab根长根数/条根长/cm2.200.84由2.840.354.40 1.52a1.980.78bc3.602.072.81 1.03h2.80 1.92由3.94 1.453.60 1.41a2.77 0.772.20 1.482.03 0.8102.40 1.52ab3.39 1.07d生长状况生长缓慢，节间短生长缓慢生长快，长势均匀生长发育良好，茎粗壮图1 A：共生致死的组培苗，B:正常共生的组培苗Fig.1 A:Ludisia discolor Seedlings by
20、 Lethal SymbioticCulture,B:Normal Symbiotic Tissue Culture Seedlings26繁殖育苗TROPICAL FORESTRYvOL.51 NO.2 Jun.2023B图3 血叶兰的炼苗移栽(以水苔基质为例)Fig.3 Transplantation of Ludisia discolor Seedlings(SphagnumSubstrate as an Example)3 结论与讨论3.1结论该研究从野生的血叶兰实生苗中分离获得6 6种内生真菌，有6 0 株内生真菌与植物存在着极为不利的关系，有6 株的内生真菌均对血叶兰存在有利的关系
21、，对苗具有促进效果。有益菌株分别为G6（链格孢属）、G9和Y21（炭疽病属）、G11和Y20（轮层炭菌属）、Y6(木霉属)等6 个菌株。血叶兰与G9号内生真菌进行共生培养时，其鲜重显著增加（55.0 1%)；经过G6和G9菌株共生培养的血叶兰无菌苗的株高、茎粗和生根数等生长发育指标均有显著促进效果；经过G11号菌株共生培养的血叶兰无菌苗的根长有促进效果。综上所述，血叶兰与G9号内生真菌进行共生培养的生长发育指标最好。血叶兰以纯水苔作为种植基质为宜，成活率达1 0 0%，植株苗壮成长。3.2讨论3.2.1不同栽植基质对内生真菌与血叶兰组培苗共生培养的影响血叶兰无菌苗移栽的成活与否跟种植的基质紧密
22、相关。植物需要在组培室内异养条件或者半自养条件转化为全自养条件，其湿度、光照强度和温度对组培苗的成活起关键作用，基质类型也不例外 1 2 。血叶兰在基质为V火山石：V泥炭=3:1 中的成活率高达91.7%，在V泥炭:V松树皮：V珍珠岩=3:1:1 的种植基质中，血叶兰组培苗的成活率达8 7.0%1 3-1 4。该实验将水苔作为血叶兰移栽炼苗的种植基质，经过有益菌株共生培养的血叶兰的成活率高达1 0 0%，几乎全部成活，植株健壮且生长发育状态良好。原因可能是炼苗基地有遮阴网，空气流畅，再加上水苔自身的保湿效果，使血叶兰苗壮成长。该实验以保水保肥能力强的纯水苔作为种植基质，植株成活率高，这一研究结
23、果与兰科植物中的铁皮石斛和泼墨石斛的移栽炼苗研究结果基本一致 1 5-1 6 。因此，血叶兰的后期炼苗，采用水苔作为基质为宜。3.2.2血叶兰共生真菌的筛选内生真菌资源在兰科植物中具有多样性，植物中分离出来的菌株也有异同。不同的内生真菌在植物生长的各阶段发挥的作用也不同，这与植物所处的环境和必需的营养物质等因素有关联。纵使兰科内生真菌资源丰富，并非全部的内生真菌都能够促进兰科植物的生长，少量的内生真菌对兰科植物组培苗具有致病性，出现这种现象的原因可能与接种内生真菌时的数量、菌苗共生的培养基和植物生长发育各阶段均有关系 1 7-1 8 ，植物所需营养超值和内生真菌菌丝的生长过于旺盛都会促使内生真
24、菌和组培苗共生的关系难以达到和谐 1 9 。五唇兰、海南钻喙兰、大花蕙兰和铁皮石斛等兰科植物的菌苗共生培养都是选择DE的培养基作为内生真菌和组培苗共生的培养基 2 0-2 。以改良的DE培养基为实验培养基，将从野生血叶兰中分离出来的6 6 株内生真菌与血叶兰无菌苗进行菌苗共生培养3 个月。结果显示，在所有内生真菌中仅有6 株内生真菌在菌苗共生培养实验中发挥一定的促进作用，占总资源比率的1 1.0 0%；有大量的内生真菌资源都会限制血叶兰无菌苗的生长发育，使其生长状态不佳，植株致死率高达8 9.0 0%。该实验初筛的有益内生真菌6 株，其对血叶兰组培苗的促生作用均有所不同。血叶兰无菌苗的生根效果
25、在G11号内生真菌共生培养中较为明显，组培苗根系最长；血叶兰组培苗的鲜重在G9号内生真菌共生培养中有所增加（55.0 1%），其株高（9.1 4cm）、茎粗（4.7 m m）、根数（3.6 0 条）等生长发育指标效果均显著优于其他菌株，原因可能是内生真菌种类的多样对血叶兰无菌苗的促生机制也多样。内生真菌和金线莲组培苗共生实验中发现有5株内生真菌对金线莲组培苗的生长发育具有促进作用，其中3 株内生真菌分别为镰刀菌属、弯劲霉属和曲霉属 2 3 ；而镰刀菌属、刺盘孢属和链格孢属等多是致病的内生真菌。研究发现从野生兰科植物中获得的镰刀菌对同科植物铁皮石斛的种子萌发具有促进效果 2 4，说明并不是所有的
26、镰刀菌都会促使植物发病。镰刀菌有致病繁殖育苗27热带林业2023 年 6 月第 51 卷第 2 期镰刀菌和非致病镰刀菌之分 2 5，而镰刀菌属具有一定刺激兰科植物种子萌发的作用，也能控制作物的枯萎病 2 6-2 7 。综上，说明兰科植物的生长与镰刀菌之间有着密切的关系。内生真菌的有利条件与植物宿主之间存在着协同的作用。植物内生真菌的丰富资源、维持机制和真菌与生态功能之间的关系需进一步探索。参考文献1盖雪鸽，邢晓科，郭顺星.兰科菌根的生态学研究进展.菌物学报,2 0 1 4,3 3(0 4):7 53-7 6 7.2王晓鸣.海南特有种华石斛菌根生物学研究 D.海口：海南大学,2 0 1 7.3单
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