1、Aug.2023Journal of Liaocheng University(Nat.Sci.)2023年8 月Vol.36No.4聊城大学学报（自然科学版）第4期第3 6 卷文章编号1672-6634(2023)04-0101-10DOI10.19728/j.issn1672-6634.2023020003一株3,5,6-三氯-2-吡啶酚降解菌的全基因组测序及功能挖掘岳彩旭，贾楠，吕雪茹，刘世豪，王圣惠（聊城大学生命科学学院，山东聊城2 52 0 59）摘要MicrococcusluteusML是从长期使用毒死蜱的农田土壤中分离出的一株能够降解毒死蜱及其高毒残留物3,5,6-三氯-2-吡啶
2、酚（TCP)的菌株。探究菌株ML降解机制，挖掘新型TCP代谢基因和特异代谢功能。采用IlluminaNovaseqPE150和OxfordNanoporeONT相结合的测序技术对菌株ML进行全基因组测序。该菌株有52 个编码基因参与了异源化合物的代谢，共有15种酶参与了TCP结构类似物，如氯苯甲酸、氨基苯甲酸盐、甲苯、萘、氯代烷烃和氯代烯烃的降解。初步推测羧甲基丁内酯酶和酰胺酶分别参与了菌株ML对TCP的脱氯和脱氯产物吡啶环中氮转化为氨的反应，这为探究MicrococcusluteusML功能基因组学研究及对TCP的降解特性提供了数据支持。关键词同3,5,6-三氯-2-吡啶酚；降解；藤黄微球菌
3、；全基因组测序；功能挖掘中图分类号X172文献标识码A开放科学（资源服务）标识码（OSID）Whole Genome Sequencing and Functional Mining ofa 3,5,6-Trichloro-2-Pyridinol Degrading StrainYUE Caixu,JIA Na,LV Xueru,LIU Shihao,WANG Shenghui(School of Life Science,Liaocheng University,Liaocheng 252059,China)Abstract Micrococcus luteus ML,capable of
4、degrading chlorpyrifos and its highly toxic residue 3,5,6-tri-chloro-2-pyridinol(TCP),was isolated from soil where chlorpyrifos has been used for a long time.To in-vestigate the degradation mechanism and mining novel TCP metabolic genes and specific metabolic func-tions of strain ML.Whole genome seq
5、uencing of strain ML with a combined sequencing technology of Ilu-mina Novaseq PE150 and Oxford Nanopore ONT was performed.There are 52 coding genes relating to xe-nobiotics biodegradation and metabolism in strain ML,and a total of 15 enzymes might be involved in thedegradation of TCP structural ana
6、logs,such as chlorobenzoic acid,aminobenzoates,toluene,naphthalene,chloroalkane and chloroalkene.It was speculated that carboxymethylenebutenolidase and amidase were in-volved in the dechlorination of TCP and the conversion of nitrogen to ammonia in pyridine ring of dechlori-收稿日期：2 0 2 3-0 2-0 3基金项目
7、：国家自然科学基金青年科学基金项目（4140 12 8 8）；山东省自然科学基金面上项目（ZR2020MD103）；大学生创新创业训练项目（CXCY2022055，CXCY2 0 2 2 2 2 3）；聊城大学畜牧学学科开放课题（319312 10 1-19,319312 10 1-2 0）资助通讯作者：王圣惠，女，汉族，博士，副教授，研究方向：环境污染物微生物修复，E-mail：w a n g s h e n g h u i l c u.e d u.c n。氯-2-102聊城大学学学报（自然科学版）nation metabolites,respectively.This article pr
8、ovides data for exploring the functional genomics of Micro-coccus luteus ML and its degradation characteristics to TCP.Keywords3,5,6-trichloro-2-pyridinol;degradation;Micrococcus luteus;whole-genome sequencing;functional mining1引言化学农药的大量使用导致我国生态环境严重污染。毒死蜱是一种高效、低毒有机磷杀虫剂，主要用于水稻、玉米、蔬菜、果树及茶树的病虫害防治。近年来，由
9、于毒死蜱在我国的大量生产和在农业中的超量使用，毒死蜱的高毒难降解残留物3,5，6-三氯-2-吡啶酚（3，5，6-trichloro-2-pyridinol，T CP）的农业生态环境污染日趋严重1-4。TCP是一种典型的氯代吡啶类化合物，目前已被国际公认为持久性有机污染物5.6 。相比母本化合物毒死蜱，TCP具有更长的半衰期（6 5-36 0 天），同时具有更高的水溶性和移动性，这些特性使其更易进人深层土壤及水体环境，最终导致地表水体和土壤的大面积扩散污染门微生物修复在清除TCP污染方面具有效率高、成本低和无二次污染等特点。目前，国内外科研工作者已经分离和鉴定了多株TCP降解菌株，如Pseudo
10、monas sp.ATCC700113、Bu r k h o l d e r i a s p.K R10 0、Paracoccus sp.TRP、Cu p r i a v i d u s n a n t o n g e n s i s XIT、Ba c i l l u s t h u r i n g i e n s i s M B497 以及 Trichosporonsp.TCF 等8-14。近年来，TCP微生物降解的研究主要集中在降解菌株的分离、鉴定、代谢途径分析和相关降解基因的克隆及表达。然而，关于降解菌株新型代谢基因和特异代谢功能挖掘的研究却鲜有报道。这直接阻碍了TCP降解菌株降解机制的
11、研究。为了挖掘TCP降解菌株中新型TCP代谢基因和特异代谢功能，本研究以实验室前期筛选获得的一株TCP降解菌株Micrococcus luteus ML为研究对象，采用llumina Novaseq PE15o和Oxford NanoporeONT相结合的测序技术对该菌株进行全基因组测序,基于完成图进行基因预测、功能注释及新型TCP代谢基因及特异代谢功能的挖掘。这不仅为TCP降解机制的研究奠定基础，还将为解决TCP及氯代芳香族化合物污染土壤及水体的微生物修复技术的开发及应用提供理论依据。2材料与方法2.1菌株菌株Micrococcus luteus ML是前期实验室从长期使用毒死蜱的农田土壤中
12、分离获得的TCP降解菌株，Genebank登人号为OK598003。2.2主要试剂及培养基标准品：TCP(99%）购自毕得医药；3,5-二氯-2-吡啶酚（98%）购自阿拉丁试剂有限公司；6-氯吡啶-2-醇（97%）和2-羟基吡啶（97%）购自上海麦克林生化科技有限公司。其他试剂：丙酮（99.5%）购自烟台远东精细化工有限公司；甲醇（HPLC级）购自赛默飞世尔科技有限公司。Luria-Bertani(LB)培养基（g/L）：蛋白陈10.0 g、酵母粉5.0 g、Na Cl 10.0 g，p H 7.0。基础盐培养基（mineral salts medium，M SM)（g/L)：NHNO1.0g
13、、Na Cl 0.5g、K H,PO 40.5g、K,H PO 41.5g、(NH 4)SO 40.5g、M g SO 40.5g、酵母粉0.0 5g,pH7.0。固体培养基为液体培养基中加人2%（w/v)的琼脂粉。2.3菌株活化与增殖从一8 0 冰箱取菌株ML菌保液10 0 uL涂布LB平板，35培养，待长出菌落后，挑取单菌落接种LB（T CP10 0 m g/L）平板，35培养3天，再次挑取新鲜单菌落接种MSM（T CP50 m g/L）平板，最终获得活化的ML菌株。挑取上述活化的菌株ML单菌落于LB培养液中，摇床35、150 r/min培养至对数生长期，室温下10 0 0 0 r/min
14、离心5min收集菌体，并洗涤菌体2 次，随后用新鲜MSM培养液重悬菌体配制成ODsoomm值为0.6 的菌悬液备用。2.4菌株降解性能分析无菌条件下，将活化的菌株ML菌悬液按10%（v/v）接种量分别接种到以TCP（50 m g/L）、3，5-二三氯-2-吡啶酚降解菌的全基因组测序及功能挖掘株3,5,6-岳彩旭，等：103第4期吡啶酚（50 mg/L）、6-氯吡啶-2-醇（2 5mg/L)和2-羟基吡啶（50 mg/L)为唯一碳源的MSM培养液中，35、150r/min避光摇床培养，每组处理均设置三个平行。未接种菌株但含有污染物的MSM培养液设置为空白对照。不同时间点收集样品，采用液相色谱测定
15、上述样品的残留。液相色谱检测条件：岛津LC-20A系统，DAD二极管阵列检测器，VP-ODSC18柱（2 50 mmX4.6mm，4.6 m），流动相为甲醇/水（8 0：2 0，V/V)，柱温40,流速1.0 mL/min，检测波长均为2 30 nm。2.5菌体收集及测序从MSM平板（TCP50mg/L)挑取活化的单菌落至LB培养液中，35、150 rpm摇床培养2 4h，然后取一定量菌浊液接种到新鲜LB培养液中进行扩大培养，摇床35、150 r/min培养至OD600mm值达到0.70.8，4条件下10 0 0 0 r/min离心5min收集菌体，液氮速冻后迅速放人干冰，随后寄送至上海派森诺
16、生物科技有限公司进行细菌基因组测序。随后，将菌株ML的全基因组序列上传至NCBI数据库，登录号为CP101528（染色体）和CP101529（质粒）2.6基因组组分分析采用GeneMarkS（v 4.32）软件对菌株ML全基因序列进行基因预测L15；分别利用tR-NAscan-SE(v1.3.1)、Ba r r n a p(v 0.9)软件和Rfam(v14.1)数据库预测tRNA、r RNA 和ncRNA1618;通过CRISPRfinder(v20170509)软件预测全基因组中的成簇的规律间隔的短回文重复序列19；采用PhiSpy(v4.2.21)软件预测基因组中存在的原噬菌体2 0 ；
17、利用抗生素抗性数据库CRAD和Blast(v2.5.0）软件，预测菌株抗生素抗性基因2 12.7基因功能分析通过Diamond(v0.8.36)软件对NR、Sw i s s-Pr o t 和EggNOG数据库进行比对，选择E-value1e-6的注释2 2-2 4；通过Blast2go(v1.0)软件对GeneOntology(GO)数据库进行注释2 5 通过Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes(KEGG)在线数据库对 KEGG 进行注释2 3结果3.1菌株ML菌落形态菌株ML在LB和MSM(TCP50mg/L）平板上菌落形态如图1所示，LB平板上菌落呈
18、圆形、黄色，隆起，表面光滑且不透明，如图1（a）。M SM（T CP50mg/L）平板上，菌落呈白色，较小，如图1（b），这种菌落差异可能是培养条件不同导致的。菌株ML能在以TCP为唯一碳源和能源的MSM平板上生长，初步证明菌株ML具有降解TCP的能力。3.2菌株ML对吡啶类化合物的降解采用HPLC分别测定不同浓度的TCP、3,5-二氯-2-吡啶酚、6-氯吡啶-2-醇和2-羟基吡啶，随(a)(b)图1菌株ML在LB平板(a)和MSM平板（TCP50mg/L)（b）上的菌落形态后以浓度为横坐标（），峰面积为纵坐标（y），绘制四种吡啶类化合物的标准曲线，并得到相对应的线性回归方程（表1）。结果显示
19、，在浓度为2 10 0 mg/L范围内，四种吡啶类化合物的线性回归方程均有良好的线性关系，相关系数R均在0.99以上，检测灵敏度满足有机污染物残留检测量标准的要求，可用于检测样品中吡啶类化合物的残留。表1四种吡啶类化合物的标准曲线吡啶类化合物名称线性回归方程R23,5,6-三氯-2-吡啶酚（TCP)y=11 258x+9 879.30.9993,5-二氯-2-吡啶酚=22814x246230.9986-氯吡啶-2-醇一7143.5r-2610.50.9982-羟基吡啶一6535.3+467890.995104聊城大学学丝报（自然科学版）在上述方法下，分别以TCP、3,5-二氯-2-吡啶酚、6-
20、氯吡啶-2-醇和2-羟基吡啶为唯一碳源，检测菌株ML对这四种吡啶类化合物的降解能力。结果如图2 所示，菌株ML在2 4h内对50 mg/LTCP降解效率达73%。在2 40 h内，对3,5-二氯-2-吡啶酚（50 mg/L）、6-氯吡啶-2-醇（2 5mg/L）和2-羟基吡啶（50 mg/L）的降解率分别为46%、6 8%和45%。以上结果表明，菌株ML同时具有脱氯和降解吡啶环的能力，其在氯代吡啶类污染物的生物修复中具有明显的应用潜力。(a)-0 h12h24h(b)-0h24h120h2508020060nvu21504010020500001234560.00.51.0 1.52.02.5
21、3.0 3.54.04.5Time/minTime/min-0h24h240h80(d)-0h24h240h8070606050nvunvu404030202010000.00.51.01.52.02.53.03.54.04.50.00.51.01.52.02.53.03.54.0Time/minTime/min图2菌株ML降解能力液相色谱图（a）T CP；（b）3,5-二氯-2-吡啶酚；（c）6-氯吡啶-2-醇；（d）2-羟基吡啶3.3基因组测序及组装为了进一步了解菌株ML的代谢功能，本研究采用IluminaNovaseqPE150和Oxford NanoporeONT相结合的测序技术对菌株
22、ML进行全基因组测序，经组装分析发现菌株ML含有一条染色体和一个质粒，如图3所示。染色体全长2 6 17 598 bp，G C含量为7 2.7 8%，编码2 38 6 个蛋白，编码序列占整个基因组序列的8 8.91%，平均长度为97 5.45bp，平均覆盖深度为7 7 1。染色体基因组还包含2 个5SrRNA、2 个16SrRNA、2 个2 3SrRNA、49个tRNA和2 2 个ncRNA，如表2 所示。质粒全长为38 147 bp，G C 含量为6 7.54%，编码43个蛋白。有研究表明，CRISPRs是细菌特有的免疫系统，它能够提高菌株抵抗各种病毒的能力2 7 ，而且携带有原噬菌体基因组
23、的细菌还具有抵抗噬菌体重复感染的能力2 8.2 9。测序结果发现，菌株ML染色体基因组中含有1个CRISPRs，其所在区域为2 592 47 52 592 57 5。同时，菌株ML染色体基因组和质粒基因组中均存在原噬菌体，其所在区域分别为7 40 0 52 7 518 2 8、1942 52 3198 6 18 7（染色体）和90 37 0 0 4（质粒）。这些数据表明，菌株ML具有抵抗病毒入侵的潜能。此外，菌株ML染色体基因组中还含有2 4个抗生素抗性基因，包括利福平抗性基因、链霉素抗性基因、艾尔法霉素抗性基因、达托霉素抗性基因以及吡嗪酰胺抗性基因等30 。综上所述，CRISPRs、原噬菌体
24、及多种抗性基因的存在利于菌株在复杂生态环境中的生长和繁殖。这为后续将菌株ML实际应用于TCP污染的生物修复提供分子生物学依据。三氯-2-吡啶酚降解菌的全基因组测序及功能挖掘105岳彩旭，等：一株3，5，6-第4期表2菌株ML基因组特征特征染色体质粒基因组大小（bp)2.617159838147GC含量(%)72.7867.54编码基因No.238643rRNAsNo60tRNAs No.490ncRNANo.220CRISPRs No.10原噬菌体No.21抗生素抗性基因No.240a(b)2500kbp35kbp5kbp500kbp30kbpplasmidl200kbp:chrLength:
25、2617598bpLength:38.147.bp1.Ok25ktp100ukbp15kbp:500khp20kbpACOGBCOGJCOGKCOGLCOGDCOGOCOGMCOGNCOGPCOGTCOGUCOGVCOGWCOGYCOGZCOGCCOGGCOGECOGFCOGHCOGICOGQCOGRCOGSCOGUnknowCOGCDStRNAtRNAOtherGCcontentGCskewGC skew-图3菌株ML的染色体（A）和质粒（B)图谱。从内到外，第一圈代表比例；第二圈代表GC倾斜；第三圈代表GC含量；第四和第七圈代表每个CDS所属的COG；第五和第六圈代表CDS（蓝色）、tRN
26、A（红色）和rRNA（粉色）在基因组上的位置。COGfunctionchassification500-400-300-200-100-0A BDEPQRSFunctionclassA:RNAprocessingandmodificationB:Chromatin structureanddynamicsC:EnergyproductionandconversionD:Cell cycle control,cell division,chromosome partitioningE:AminoacidtransportandmetabolismF:Nucleotidetransportandm
27、etabolismG:CarbohydratetransportandmetabolismH:CoenzymetransportandmetabolismI:LipidtransportandmetabolismJ:Translation,ribosomal structureand biogenesisK:TranscriptionL:Replication,recombinationandrepairM:Cellwall/membrane/envelopebiogenesisIN:CellmotilityO:Posttranslational modification,protein tu
28、rnover,chaperonesP:lnorganiciontransport andmetabolismQ:Secondary metabolites biosynthesis,transport and catabolismR:Ceneral function prediction onlyS:FunctionunknownT:Signal transductionmechanismsU:lntracellulartrafficking,secretion,andvesiculartransportV:DefensemechanismsW:ExtracellularstructuresY
29、:NuclearstructureZ:Cytoskeleton图4菌株ML的COG功能分类图有3.4.106聊城大学学报（自然科学版）3.4基因功能注释3.4.1COG数据库注释。COG(Clusters of Orthologous Groups of proteins)注释是在对已完成基因组测序物种的蛋白质序列进行相互比较的基础上构建的31。通过基因预测，菌株ML共预测得到2 38 6 个蛋白编码基因，与COG数据库进行blast比对分析发现，共有2 0 6 4个蛋白编码基因注释到COG功能如图4所示，占基因组的8 6.5%。这些基因的功能主要集中在复制/重组/修复（10.8 0%)；氨基
30、酸运输与代谢（8.2 4%）；翻译、核糖体结构和生物生成（7.0 7%）；无机离子运输与代谢（6.0 6%)；能源生产和转化（5.8 6%）；转录（5.0 4%）；碳水化合物转运与代谢（4.6 5%）等方面。3.4.2GO数据库注释。GO(Gene Ontology)注释包括细胞组分、分子功能及生物过程三大类2 5。通过对菌株ML基因组进行蛋白功能分析,共有17 6 3个蛋白编码基因注释到GO功能，如图5所示，占基因组的73.89%。其中，用于描述亚细胞结构、位置和大分子复合物的细胞组分中，膜和细胞质的组成部分注释的基因数分别为40 8 和331个；用于描述基因及其产物功能的分子功能中，如与离
31、子结合、DNA结合和氧化还原酶活性相关的注释基因数分别为52 7、2 97 和2 6 0；用于描述基因编码产物所参与的生物过程的注释基因数较多，主要集中在细胞氮代谢（6 7 7）、生物合成（593）、小分子代谢（490）、转移（2 6 0）和分解代谢（2 40)等功能。GOclassficationBiologicalprocess1678Cellularnitrogen compoundmetabolic process677Biosyntheticprocess593Smallmoleculemetabolic process490Transport260Catabolic process
32、240Translation102Carbohydratemetabolic processCofactormetabolicprocessLipidmetabolicprocessResponsetostressProteinmaturationCellularproteionmodification processTranspositionGeneration of precursor metabolites and energySulfurcompoundmetabolic processSignaltransductionCelldivisionCell cycleRibosomebi
33、ogenesisCellwallorganization orbiogenesisHomeostaticprocessCellmorphogenesisAnatiomical structuredevelopnrentCellularcomponentassemblyProtcinfoldingChromosome segregationPhotosynthesis6CelladhesionMembraneorganizationReproduction222CelldeathSymbiosis,encompassingmutualism through parasitismChromosom
34、eorganizationNitrogencyclemetabolicprocessmRNAprocessSecondarymetabolic processCell549Cellularcomponent424Intracellular408Cytoplasm331Plasmamembrane150Organelle70Protein complex53External encapsulatingstructure12CytosolThylakoidExtracellularregionMolecularfunctionH644lonbinging572DNAbinging297Oxidor
35、eductaseactivity260Lyaseactivity多多苹129RNAactivityIIGASEactivityIsomeraseactivityKinaseactivityTransferase activity,transferring acyl groupsNucleic acid binging transcription factor activityMethyltransferaseactivityStructural moleculeactivityTransferase activity,transferring glycosylgroupsHydrolase a
36、cyivity,acting on carbon-nitrogen(but not peptide)bondsNucleotidyltransferaseactivityHelicaseactivityTransferase activity,transferring alkyl or ary(other than methyl)groupsPhosphataseactivityHydrolaseactivity,acting onglycosylbondsEnzymebingingProtein binding transcription factor activity6Enzymeregu
37、latoractivityLipidbinging3500100015002.000Numberof Genes图5菌株ML的GO功能分类图3KEGG数据库注释。KEGG(Kyoto Encyclopediaof GenesandGenomes)数据库既是基因组研究方面的公共数据库，又是系统分析基因功能及关联基因组信息和功能信息的综合数据库32 。菌株ML中107三氯-2-吡啶酚降解菌的全基因组测序及功能挖掘岳彩旭，等：一株3，5.6-第4期1248个蛋白编码基因注释到KEGG功能，如图6 所示，占基因组的52.31%。KEGG功能分为8 大类，分别是层次结构（Britehierarchies
38、）（6 5.38%）、细胞过程（Cellularprocesses）（5.2 9%）、环境信息处理（Envi-ronmental information processing)(11.54%）、遗传信息处理(Genetic information processing)(16.03%)、人类疾病（Human diseases)（5.93%）、代谢（Metabolism）（8 4.13%）、未知功能基因（Not included in path-wayorbrite)（16.0 3%）和生物系统（Organismal systems）（4.8 1%）。在KEGG功能注释中，与代谢通路具有相关性的
39、基因数最多，其中异源化合物生物降解和代谢（Xenobiotics biodegradation and metabolism）的基因数占注释到KEGG功能的蛋白编码基因的4.17%;其中共52 个基因参与了异源化合物的生物降解和代谢，进一步分析发现有15种酶参与氯代芳香族化合物，如氯苯甲酸、氨基苯甲酸盐、甲苯、萘、氯代烷烃和氯代烯烃的降解（表3）。KEGGclassficationProtein families:genetic information processing398Protein families:signaling.and cellular processing261Prote
40、infamilies:metabolism157Cellularcommunity-prokaryotes33Cell growthanddeathH18Transportandcatabolism14Cell motilitySignal transduction77Membranetransport67Translation175Replicationand repair168Folding,sorting and degradation-35TranscriptionCancer:overview19Infectiousdisease:bacterial2Drugresistance:a
41、ntimicrobial112Endocrine and metabolic disease7Neurodegenerativedisease6Drugresistance:antineoplastic5Substancedependence3Infectiousdisease:viral2Infectious disease:parasiticImmunediseaseCardiovasculardisease22Cancer:specifictypesAminoacidmetabolism-267Carbohy drate metabolism260Metabolism ofcofacto
42、rs and vitamins108Energymetabolism95Lipid metabolismNucleotidemetabolismXenobiotics biodegradation and metabolism152Metabolismof otheraminoacids40Metabolism of terpenoids and polyketidesBiosynthesis of other secondarymetabolismGlycanbiosynthesis andmetabolism21Uncalssified:metabolism79Uncalssified:g
43、enetic information processing54Poorlycharacterized4十Uncalssified:signaling and cellular processes-26Endocrinesystem121Aging17Nervous systemH10Environmental adaptation6Excretorysystem4ImmunesystemDigestives ystem十100200300400500Numberof Genes图6菌株ML的KEGG功能分类图4讨论4.1新型TCP代谢基因目前，TCP微生物降解的研究多集中在在TCP高效降解菌株
44、的筛选及代谢途径分析，而对TCP降解基因的报道较少。起初，在菌株Cupriavidus pauculus P2中克隆到了一个由五个基因组成的TCP降解基因簇，该基因簇中的单加氧酶基因（tcpA1)和黄素还原酶基因（tcpB1)所编码的两种酶能够共同催化TCP降解，最终生成3,6-二酮-2,5-二羟基吡啶33。之后，在菌株Ralstonia sp.T6中也发现了两个TCP降解基因簇tcpRXA和dhpRIJK，t c p RXA 编码的酶能够催化TCP转化为3，6-二酮-2，5-二羟基吡啶，dhpRIJK基因簇编码的酶则能够将生成的3,6-二酮-2,5-二羟基吡啶进一步转化为5-氨基-2，4,5
45、-三氧戊酸，最终矿化为无毒无害的物质34。随后，在菌株Cupriavidus nantongensisX1T中鉴定了两个降解TCP的关键基因朱108聊城大学学报（自然科学版）tcpA和fre，两者编码的酶能催化3,6-二氯-2,5-二羟基吡啶的邻位和间位脱氯，最终形成3，6-二酮-2,5-二羟基吡啶，从而实现TCP的脱毒12 。在本研究中，我们通过对Micrococcus luteus ML的基因组测序、组装和注释，发现15种酶可能参与了TCP及其类似物的降解，并进一步推测羧甲基丁内酯酶和酰胺酶在菌株ML对TCP的脱氯降解和其脱氯产物吡啶环中氮转化为氨的反应中发挥了重要作用。目前，已有文献发现
46、羧甲基丁内酯酶能催化碳-卤键断裂，它通过脱卤反应将5-氟粘性内酯或4-氟粘性内酯转化为2-马来酸盐和氢氟酸，在该反应中羟基取代氟从而形成相应的醇类物质35。由此，我们推测该酶也可能参与了菌株ML对TCP的脱氯反应；同时，另有文献报道，酰胺酶能将苯甲酰胺转化为苯甲酸盐和氨36 。在此基础上，我们推测酰胺酶也可能参与了菌株ML代谢吡啶环中氮转化为氨的反应。此外，其它13种酶，如醛脱氢酶（NA D+）、醇脱氢酶、S-（羟甲基)谷胱甘肽脱氢酶、3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶和谷胱甘肽依赖型甲醛脱氢酶属于氧化还原酶类，这些酶主要催化两个分子间的脱氢或加氧反应37 ；烯酰辅酶A水合酶属于裂解酶催化裂解碳氧键38
47、 ；而乙酰辅酶AC-乙酰转移酶主要负责将化合物中的乙酰辅酶A转移到其他基团上39。我们初步推测这三类酶参与了TCP脱氯后吡啶环的氧化裂解。上述推测，仍需要下一步对这些酶的编码基因进行功能验证。表3菌株ML中可能参与氯代芳香族化合物代谢途径的酶名称基因组位置大小（bp)参与代谢途径醛脱氢酶（NAD+）6479566309;233254523340201515;1.476氯代烷烃和氯代烯烃醇脱氢酶255399625550571062萘、细胞色素P450、氯代烷烃和氯代烯烃醇脱氢酶（丙醇倾向性）242889924299301032、细胞色素P450、氯代烷烃和氯代烯烃S-（羟甲基）谷胱甘肽脱氢酶72
48、39372513;190506919062441176;1.176萘、细胞色素P450、氯代烷烃和氯代烯烃3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶23094342310321888苯甲酸盐谷胱甘肽独立的甲醛脱氢酶445096-4462891.194.氯代烷烃和氯代烯烃谷氨酰辅酶A脱氢酶258591825871441227苯甲酸盐3-羟基酰基辅酶A脱氢酶234897823511432166苯甲酸盐和内酰胺烯酰辅酶A水合酶283401284198798苯甲酸盐、氨基苯甲酸盐和已内酰胺86933987054;132190913232521209;1344乙酰辅酶AC乙酰转移酶2 2 158 7 7 2 2 17 0
49、 2 52 30 7 418 2 30 8 6 351149;1 218苯甲酸盐235120223524161215羧甲基丁内酯酶4890949634726氟苯甲酸盐、甲苯、氯代环已烷和氯苯葡萄糖酸内酯酶161592162488897已内酰胺酰胺酶72805743131509氨基苯甲酸盐和苯乙烯单胺氧化酶117139111729231.533细胞色素P450类固醇Delta异构酶149796414990371074类固醇4.2特异代谢功能藤黄微球菌（Micrococcusluteus）广泛存在于土壤和水体环境中。目前，有文献发现，Micrococcuslute-us 能够耐受并去除少量的萘、菲
50、、荧葱和芘等环境污染物，具广谱的土壤污染修复性能40 。而我们筛选的MicrococcusluteusML不仅能降解TCP，还能降解3,5-二氯-2-吡啶酚、6-氯吡啶-2-醇和2-羟基吡啶等氯代吡啶类化合物。同时，基因组水平KEGG代谢通路进一步挖掘发现该菌株还含有代谢氯代芳香族化合物，如氯苯甲酸、氨基苯甲酸盐、甲苯、萘、氯代烷烃和氯代烯烃的代谢基因。我们的研究结果与之前文献报道一致。最近还有研究报道，该菌属的菌株还具有促进植物生长的能力41。以上结果说明藤黄微球菌属的菌株在处理氯代芳香族化合物污染土壤的环境生物修复中具有明显的应用潜力。5结论本研究通过IlluminaNovaseqPE15